CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) hirugarren belaunaldiko genomaren edizio-teknika bat da, mundua irauli duena bere emaitzekin. Hainbat gaixotasun eta infekzio biologiko tratatzeko erabili da. Hainbat bakteriok eta beste prokarioto batzuek (arkea bezalakoek) ere CRISPR/Cas9 sistemak dituzte fagoen aurka defendatzeko. Jakinarazi da CRISPR/Cas9 oinarritutako estrategiek bularreko minbizi hirukoitz negatiboaren (TNBC) hazkuntza eta progresioa inhibi dezaketela, erresistentzia-gene aldatuak, transkripzioa eta erregulazio epigenetikoa helburu hartuta. Esku-hartze terapeutiko hauek TNBC-n ere ikusten den erresistentzia bezalako arazo zailak konpontzen lagun dezakete. Gaur egun, hainbat metodo erabiltzen dira CRISPR/Cas9 zelula helburuetara emateko, hala nola fisikoak (mikroinjekzioa, elektroporazioa eta modu hidrodinamikoak), biralak (adeno-lotutako birusak eta lentibirusak) eta ez-biralak (liposomak eta lipido nanopartikulak). )-partikulak). Hainbat eredu garatu diren arren TNBCren kausa molekularrak aztertzeko, in vivo genoma editatzeko tresnak emateko metodo sentikor eta zuzenduen faltak haien aplikazio klinikoa mugatzen du. Laburbilduz, berrikuspen honek sakon aztertzen ditu CRISPR/Cas9 tratamenduaren aurrerapena, erronkak, mugak eta aukerak TNBCrako, dauden ebidentzian oinarrituta. Era berean, nabarmentzen dugu nola adimen artifizialaren eta ikaskuntza automatikoaren konbinazioak CRISPR/Cas9 estrategiak hobetu ditzakeen TNBCren tratamenduan.
Minbizia zelula-zatiketa kontrolatu gabeak, zelula-zikloaren kontrol-puntuen etenak eta tumore-zapaltzaileen geneen (TSG) mutazioek ezaugarritzen dute (Matthews et al., 2022). Minbizi mota desberdinen artean, bularreko minbizia da emakumeengan ohikoena den minbizi mota eta mundu osoan hilkortasun-tasa altua du (Waks eta Winer, 2019). Bularreko minbizia gaixotasun heterogeneoa da, ezaugarri anitzak dituena, hala nola ezaugarri histologiko eta biologikoak, aurkezpen klinikoa eta portaera, eta tratamenduarekiko erantzuna (Weigelt et al., 2010). Bularreko minbiziaren sailkapenak informazio zehatza ematen du bularreko minbiziaren diagnostikorako eta tumorearen pronostikorako. Biomarkatzaile komunak eta ezaugarri klinikopatologikoak erabiltzea izan da bularreko minbizia sailkatzeko irizpide nagusia (Tsang eta Tse, 2019). Bularreko minbiziaren pronostikoa eta tratamenduarekiko erantzuna hainbat faktorek eragiten dute, besteak beste, estrogeno hartzailearen (ER), progesterona hartzailearen (PR), gizakiaren hazkuntza-faktore epidermikoaren 2. hartzailearen (HER2/neu) presentzia, eta maila histologikoa, tumore mota eta maila. tamaina eta gongoil linfatikoen metastasia (Al-Tubaiti, 2020). Bularreko minbiziaren bost azpimota molekular intrintseko identifikatu dira, besteak beste, A luminala, B luminala, HER2-n aberastua, basal-antzekoa eta klaudina gutxikoa (Prat et al., 2015). TNBC minbiziaren azpimota molekular bat da, eta ez ditu ER, PR eta HER2 guztiak adierazten (Yin et al., 2020). Ezaugarri patologiko hauek TNBCrekin lotuta daude, eta horrek berresten du bere progresio azkarra eta beste edozein bularreko minbizi mota baino izaera oldarkorragoa (Feng et al., 2018). Horrez gain, Peru et al.-ek (2000) mikroarray teknologia erabili zuten bularreko minbizia birsailkatzeko eta bularreko minbiziaren bost azpimota intrintseko identifikatzeko (Cadenas, 2012). Basal-antzeko bularreko minbizia bularreko minbiziaren azpimota bat da, fenotipo hirukoitz negatiboa duena eta progresio azkarrarekin lotuta dagoena. Kontuan izan behar da bularreko minbizi basal guztiak TNBC gisa diagnostikatzen direla oker, baina % 77 baino ez direla TNBC; Aitzitik, TNBCren % 71-91 dira basal itxurakoak, eta horrek adierazten du bi bularreko minbizi mota hauek gainjartzen direla eta sailkapen desberdinak ordezkatzen dituztela (Wang D.-Y. et al., 2019). Horrek TNBCren heterogeneotasuna karakterizatu beharra sortzen du pronostikoa argitzeko eta egungo eta etorkizuneko tratamenduei eman dakizkiekeen erantzun potentzialak identifikatzeko. Horrez gain, TNBCk bularreko minbizi kasu guztien % 15-20 hartzen du eta ohikoagoa da 50 urtetik beherako emakumeengan. BRCA1 edo BRCA2 mutazioak TNBC kasuen % 20 ingurutan jakinarazi dira (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Ikerketek erakutsi dute TNBC-k immunitate-mikroingurune bereizgarria duela, eta bertan daude hazkunde-faktore endotelial baskularrak, tumoreekin lotutako makrofagoak (TAM), tumoreetan infiltratzen diren linfozitoak (TIL) eta tumoreen hazkuntzan eta migrazioan parte hartzen duten beste molekula batzuk. Beraz, TNBC-ren mikroingurunea ulertzea ezinbestekoa da bere pronostikorako eta tratamendurako (Fan eta He, 2022).
TNBCren pronostikoa ebaluatzeko eta tratamendu eraginkorra bermatzeko, garrantzitsua da diagnostiko zehatza egitea, batez ere immunohistokimikan (IHC) oinarrituta ER, PR eta HER2 detektatzeko, eta mamografian bularreko neoplasiak detektatzeko. Hala ere, mamografiak ezin ditu behar bezala irudikatu tumore barruko ezaugarriak, hala nola nekrosia eta fibrosia (Deepak Singh et al., 2021). Pronostiko eta diagnostiko txarrek medikuei botika egokiak errezetatzea eragozten dietenez (Chaudhary, 2020), hainbat estrategia erabiltzen dira TNBC duten pazienteen arreta hobetzeko. Gaur egun, bi sendagai, doxorrubizina eta ziklofosfamida, erabiltzen dira TNBC duten pazienteetan eta emaitza onak erakutsi dituzte. Horrez gain, beste platinozko sendagai batzuk erabiltzen dira, hala nola karboplatinoa eta cisplatinoa (Sikov et al., 2015). Horrez gain, PARP inhibitzaileak, hala nola Olaparib, Velaparib eta PF-01367338, erabili dira TNBC tratatzeko kimioterapia-sendagai potentzial gisa (Ishino et al., 2018). Wnt/b-Catenin, NOTCH eta Hedgehog seinaleztapen-bideek TNBCren agerpenean eta progresioan parte hartzen dutela jakinarazi denez, sendagaiak bide horietara bideratzea estrategia garrantzitsua izan daiteke (Aysola et al., 2013). Kirurgia, erradioterapia eta kimioterapia TNBCren tratamenduaren oinarria diren arren gaur egun, aurrerapen nabarmenak egin dira tratamendu berriak garatzen, besteak beste, terapia zuzendua, immunoterapia, CRISPRrekin lotutako hainbat gene-edizio tresna, hala nola Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime edizioa eta CRISPR/Cas9-bideratutako gene-terapia. Hemen, TNBCren tratamenduan erabiltzen diren CRISPRrekin lotutako hainbat gene-edizio tresnatan zentratuko gara. Horien artean, CRISPR/Cas9-k arreta handia jaso du.
Cas9n, Cas9 nikasa izenez ere ezaguna, CRISPR/Cas9 genoma editatzeko sistematik eratorritako Cas9 proteinen aldaera genetikoki diseinatua da (Gupta et al., 2019). Jatorrizko forman, Cas9 proteinak bi nukleasa domeinu ditu: RuvC eta HNH, eta horien funtzio nagusia bi DNA kateen ebakidura da. Hala ere, Cas9n-en, nukleasa domeinuetako bat, HNH, genetikoki mutatzen da eta inaktibo bihurtzen da. Hori dela eta, Cas9n-en HNH domeinua ez da funtzionala izaten jarraitzen. RuvC domeinua bakarrik geratzen da aktibo, Cas9n-ek DNA kate bakarreko hausturak moztu edo sortzeko aukera emanez (Trevino eta Zhang, 2014). Cas9-ekin alderatuta, Cas9n-ek eraginkortasunez murriztu ditzake helburutik kanpoko efektuak eta zelulen konponketa mekanismoak hobetu. Cas9n hainbat arazo konpontzeko erabil daiteke, hala nola DNA kate bikoitzeko kokapen zehatzetan hausturak sortzeko. Horretarako, bi Cas9n molekula konbinatu eta elkarrekin erabili ziren (Yee, 2016). Lerro mistoko kinasa 3 (MLK3) mitogenoek aktibatutako proteina kinasa bat da, TNBC metastasian zehar erregulatzaile gako gisa jokatzen duena (Cronan et al., 2012).
MLK3-k hainbat seinaleztapen-bide aktibatu ditzake TNBC metastasia eraginez. Adibidez, c-Jun N-terminal kinasa (JNK) bideak zelulen mugikortasuna eta matrize estrazelularraren degradazioa erregulatzen ditu, eta MLK3-k JNK bidea aktibatzen du, horrela zelulen mugikortasuna hobetuz eta propietate inbaditzaileak emanez (Rattanasinchai eta Gallo, 2016). MLK3-k EMT ere erregulatzen du. Horretarako, beheranzko transkripzio-faktoreak aktibatzen ditu, hala nola Snail, Slug eta Twist. Faktore hauek epitelio-markatzaileen adierazpena inhibitzen dute eta mesenkima-markatzaileen adierazpena sustatzen dute, fenotipo metastatikoa eskuratzea eraginez (Casalino et al., 2023). MLK3-k zeregina betetzen duela ikusi da ECM birmoldaketan eta ECM degradatzen duten matrize-metaloproteinasak (MMP) bezalako proteasen aktibazioan. Horrek tumore-zelulen inbasioa eta urruneko guneetara hedatzea errazten du (Katari et al., 2019). Beraz, aurreko ikerketek erakutsi dute MLK3-k funtsezko zeregina betetzen duela TNBC-n. Rattanasinchai eta Gallo-k TNBC ereduak erabili zituzten MLK3-ren eginkizuna aztertzeko eta ikusi zuten minbiziaren garapena sustatzen duela seinaleztapen bide espezifikoen bidez. CRISPR/Cas9n erabili zuten MLK3 editatzeko eta TNBC metastasiaren murrizketa nabarmena ikusi zuten (Rattanasinchai eta Gallo, 2016).
dCas9, askotan Cas9 inaktiboa deitua, Cas9 proteinen deribatu aldatu bat da. Cas9 aktiboa ez bezala, dCas9-k ez du endonukleasa jarduerarik, eta horrek ezin du DNAren kate bikoitzeko hausturarik eragin. Beraz, dCas9 genomaren eskualde espezifikoak zehaztasunez helburu gisa hartzera erabil daiteke, DNA sekuentzian aldaketarik edo modifikaziorik egin gabe (Wang et al., 2016). dCas9-n, bi endonukleasa proteina, RuvC eta HNH, inaktibatzen dira aminoazido hondakin garrantzitsuak ezabatuz. (Richter et al., 2016). DNAren ebakitze jarduerarik ez duen arren, dCas9-k hainbat rol garrantzitsu betetzen ditu ikerketa genetikoan eta bioteknologian. Adibidez, genomaren eskualde espezifikoak bistaratzea ahalbidetzen du, transkripzio erregulazioa errazten du eta aldaketa epigenetikoak sustatzen ditu (Brocken et al., 2018).
ZEB1 transkripzio faktoreak (zink hatz E-kutxa lotura homeokutxa 1) zeregin espezifiko eta kritikoa du epitelio-mesenkima trantsizioan (EMT) bitartekaritzan, enbrioiaren garapenean, ehunen konponketan eta minbiziaren progresioan gertatzen den prozesu zelularra. Zelula epitelialak zelula mesenkimaletan eraldatzen ditu, eta horrek aldaketak eragiten ditu zelulen morfologian, mugikortasunean, inbasioan, etab. (Wu et al., 2020). ZEB1-ek hainbat markatzaile epiteliali inhibitzen ditu, hala nola E-kaderina eta Okludina, eta hauek zelula-zelulen atxikimendua eta zelula epitelialen polaritatea mantentzeaz arduratzen dira TNBC-n (Moreno-Bueno et al., 2008). Horrez gain, ZEB1-ek markatzaile batzuk aktibatzen ditu, hala nola N-kaderina, bimentina eta fibronektina (Konradi et al., 2014), eta zitoeskeletoaren birmoldaketan parte hartzen duten geneak ere erregulatzen ditu, hala nola Rho GTPasak eta matrize metaloproteinasak (MMPak) (Huang et al., 2014). 2022), gainera, hainbat seinaleztapen-bidetan ere eragiten du, hala nola hazkuntza-faktore eraldatzailea-β (TGF-β), Wnt seinaleztapena, etab., horrela tumoreen inbasioa eta metastasia sustatuz TNBC-n (Chen et al., 2016). Hainbat ikerketek eta ebidentzia zientifikok adierazten dute ZEB1-ek potentzial handia duela TNBC detektatzeko eta esku-hartze terapeutikorako agente baliotsu gisa. Duela gutxiko ikerketa batean, Waryah et al.-ek TNBC eredu bat erabili zuten eta ZEB1 erabat zapaltzea lortu zuten dCas9-ren bidez. Horrela, espezifikotasun oso altua eta ZEB1-en ia inhibizio osoa ikusi zuten in vivo baldintzetan (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 CRISPR/Cpf1 izeneko geneak editatzeko tresna bat da. CRISPR/Cas sistematik eratorria da, non Cas12 terminoak CRISPRrekin lotutako 12 proteinari egiten dion erreferentzia (Bharathkumar et al., 2022), Cas9-ren guztiz antzekoa dena. Desberdintasun bakarra Cas12 proteina duela da. Cas9-rekin alderatuta, Cas12-k funtzio berezi batzuk ditu, hala nola, geneak editatzeko prozesuan mutur itsaskorrak sortzea, Cas9-k, berriz, mutur kamutsak sortzen ditu (Wang et al., 2021). Cas12-ren propietate honek bere DNA manipulatzeko teknologia espezifikoan laguntzen du. Helburuko DNA zehatz-mehatz ezagutu eta ebakitzeko gai den proteina gisa, oso moldakorra da, eta hainbat aplikaziotarako tresna eraginkorra bihurtzen du, geneak editatzeko tresna barne (Pickar-Oliver eta Gersbach, 2019).
Beste CRISPR aldaera batzuen antzera, CRISPR/Cas12 gai da TNBC-ko geneak ezabatzeko edo aktibatzeko, bere patogenesian edo tratamenduarekiko erantzunean paper garrantzitsua betetzen duten geneak helburu hartuta (Yang eta Zhang, 2023). Prozesu hau burutzeko, gida-RNA (gRNA) bat garatu zen, Cas12 helburu-geneari zuzentzen diona. Cas12 bere helburura lotzen denean, DNAn kate bikoitzeko hausturak sortzen ditu eta DNAren konponketa-mekanismoak aktibatzen ditu. Konponketa-prozesuan zehar, nukleotido okerrak sar daitezke, geneen mutazioak eta funtzio-galera eraginez (Zhang et al., 2021a). Horrez gain, Cas12 entzimaren bertsio hobetu bat (dCas12 izenekoa) ere erabili zen geneak aktibatzeko. Transkripzio-aktibatzaile batekin konbinatuz, gene batzuk eragitea posible da, eta horrela aktibatu. Teknologia honek potentzial handia du tumore-zapaltzaileen geneen aktibazioa sustatzeko (Sultan et al., 2022).
Prime edizioa genomaren edizio-teknologia berri eta oso hobetua da. Organismo baten DNA oso zehatz aldatzeko gai da (Chen eta Liu, 2023). Prime edizioa bi osagai nagusi integratuz lortzen da: CRISPR/Cas9 entzima aldatu bat eta alderantzizko transkriptasa. CRISPR/Cas9 entzimaren eginkizuna genomaren gune zehatzak selektiboki bideratzea da, alderantzizko transkriptasak, berriz, helburuko kokapenean DNA sakonki aldatzen laguntzen du (Hassan et al., 2021). Primer edizio-mekanismoan, lehen urratsa primer edizioaren gida-RNA (pegRNA) bat sortzea da (Standage-Beier et al., 2021). Helburuko DNAn nahi den edizio-guneari dagokion helburu-sekuentzia eta RNA txantiloia ditu. Ondoren, pegRNA helburu-zeluletan sartzen da primer edizio-nukleasa batekin (PE2) batera. PE2 Cas9 entzima batek, alderantzizko transkriptasa batek eta primer edizio-egokitzaile batek osatutako fusio-proteina bat da (Martín-Alonso et al., 2021). Zelularen barruan, pegRNA eta PE2 konplexuek aldatu nahi duten DNA espezifikoa bilatzen dute. Cas9 entzimak DNA mozten du eta kate bakarrez osatutako txantiloi bat sortzen du (Choi et al., 2022). Alderantzizko transkriptasak txantiloi hau erabiltzen du DNA editatzeko prestatzeko. DNA kopiatzeaz gain, RNA txantiloia editatzeko argibideak ere sartzen dira. Azkenik, sortutako DNA kate berria txantiloi gisa erabiltzen da DNAren haustura konpontzeko, eta horren ondorioz, nahi den aldaketa duen DNA sekuentzia aldatu bat sortzen da (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Primer edizio mekanismoek geneetan mutazio zabalak eragin ditzakete. Mutazio puntualak, txertaketak, ezabaketak eta baita geneen ordezkapenak ere helburu izan ditzake (Anzalone et al., 2019; Chen eta Liu, 2023). Prime edizioak hainbat abantaila eskaintzen ditu aurreko genomaren edizio teknologiekin alderatuta. Horien artean, zehaztasun handiagoa, helburutik kanpoko efektuak murriztea eta DNAren kate bikoitzeko hausturen menpe egon gabe DNA editatzeko gaitasuna daude (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9 teknologia jatorriz bakterioak plasmidoen transferentziatik eta fagoen infekziotik babesteko garatu zen, eta geroago genoma editatzeko RNA oinarritutako DNA bideratzeko tresna eraginkor gisa berrerabili zen (Jiang eta Doudna, 2017). Horrez gain, CRISPR/Cas9 sistema bakterio eta arkeo genomaren % 50ean eta % 87an dagoela jakinarazi da, hurrenez hurren (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 edozein sekuentzia genetiko anormal ezabatzeko, txertatzeko eta zuzentzeko tresna potentziala da in vivo eta in vitro moduak erabiliz (Sabit et al., 2021). Gainera, CRISPR/Cas9 sistema immunologiko moldatzailearen parte dela frogatu da, intereseko geneetarako duen espezifikotasunagatik (Chen eta Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 Cas9z eta gida-RNA bakar batez (sgRNA) osatuta dago. Cas9 hainbat proteina-osagaiz osatutako endonukleasa bat da. Gainera, Cas9k egitura- eta konformazio-propietate bereziak ditu (Pacesa et al., 2022), bi lobuluz osatuta baitago: aitortza (REC) eta nukleasa (NUC). REC lobulua hiru eskualdetan banatzen da: REC1, REC2 eta zubi-helizeak (Cromwell et al., 2018). NUCak hiru lobuluz osatuta dago, hots, RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH eta protoespaziatzailearen ondoko motiboaren (PAM) interakzio-domeinua (1. irudia) (Song et al., 2016). sgRNAk bi osagai ditu, CRISPR RNA (crRNA) eta transkodetzen duen RNA txikia (trazer RNA) barne (1. irudia). sgRNA-k Cas9 proteina konexinekin lotzen du konplexu aktibo bat osatzeko, efektore konplexu gisa ere ezagutzen dena (Richter et al., 2012). crRNA 18-20 nukleotidoko base pare bat da, eta funtsezko zeregina du DNA sekuentziak ezagutzeko. Horrez gain, crRNA-k DNA helburuarekin parekatzen da, eta tracrRNA-k Cas9 nukleasarentzat egitura gisa jokatzen du DNA helburuarekin lotzeko (Manghwar et al., 2019). Bestalde, PAM sekuentziak 3 nukleotido ditu, eta horrek efektore konplexuaren DNArekin duen lotura baieztatzen, zehazten eta bitartekatzen du. Cas9 proteina konplexuaren RuvC eta HNH azpiunitateek jarduera katalitikoa dute (Richter et al., 2012; Asmamaw eta Zawdie, 2021). Cas9 azpiunitatearen HNH nukleasa domeinuak crRNA-rekin lotutako DNA katea ebakitzen du. RuvC nukleasa domeinuak beste DNA kate batzuk zatitzen ditu eta kate bikoitzeko hausturak (DSB) sortzen ditu, eta ondoren bi DNA haustura konpontzeko mekanismo desberdin aktibatzen dira (Jiang eta Doudna, 2017) (1. irudia).
1. irudia. CRISPR/Cas9ren ikuspegi orokorra (A). CRISPR/Cas9 sistemaren osagaiak: (i). Cas9 endonukleasa DNA sekuentzia helburuaren mozketaz arduratzen da, (ii) crRNA eta tra-crRNA kimeraren fusiotik sortutako gida-RNA bakarra (sg). (bi). Cas9k hainbat osagai ditu, hala nola Rec I, Rec II, NUC lobulua (HNH eta Ruv C azpiosagaiak dira) eta PAM interakzio domeinua (C), dagokien funtzioekin. CRISPR/Cas9 proteina konplexuak DNA sekuentziak forma ez-osagarri eta osagarrietan zatitzen ditu (D). CRISPR/Cas9k genoma hiru etapatan editatzen du: aitortza, ebaketa eta konponketa. Diseinatutako sg-RNAk Cas9 gidatzen du eta nahi den sekuentzia ezagutzen du crRNA osagai osagarriaren bidez. Cas9k PAM sekuentzia ezagutzen du 5′-NGG-3′-n eta DNA urtzen du, DNA-RNA hibrido bat eratuz eta zatiketa aktibatuz. Cas9-ren HNH domeinuak kate osagarria ebakitzen du, eta RuvC domeinuak kate ez-osagarria. CRISPR/Cas9-k dsDNA konpontzen du bi modutan hautsiz: mutur ez-homologoen elkarketa (NHEJ) eta homologia zuzendutako konponketa (HDR). NHEJ-k DNA bikoitz-katea konpontzen du DNA homologo arrotzik ez dagoenean prozesu entzimatiko baten bidez, DNA sekuentziak ausaz sartu edo kendu ditzakeen mekanismo akastun baten bidez. HDR oso espezifikoa da eta DNA homologo txantiloiak behar ditu.
CRISPR/Cas9-k bitartekatutako konponketa-bideek mutur ez-homologoen elkartzea (NHEJ) eta homologia bidezko konponketa (HDR) mekanismoak barne hartzen dituzte. NHEJ errore-joera duen bidea da, txertatzea edo ezabatzea dakarrena eta ez duelako inolako eredurik behar konponketa-mekanismoan zehar. Ausazko nukleotidoak erabiltzen ditu proteina estandarrak sortzeko (Abbasi et al., 2021). Konponketa-sistema honek lau konplexu ditu: KU konplexua, 4. motako gurutzaketa-osagarri proteina konplexua (XRCC-4), DNAren muturren prozesatzeko entzima eta DNA-PKcs proteina kinasa (Abbasi et al., 2021). KU konplexu proteinak bi azpiunitate ditu, Ku 70 eta Ku 80, eta paper garrantzitsua betetzen du NHEJ mekanismoan, konponketa mekanismoa bi azpiunitate (Ku 70 eta Ku 80) DNA helburuaren mutur kamuts edo ia kamutsetara lotzean hasten baita (Abbasi et al., 2021), NHEJrekin lotutako beste faktore batzuk lesioaren gunera erakartzeko egitura gisa balioz (Yang et al., 2020). XRCC-4 eta DNA ligasa 334 eta 911 aminoazidoz osatuta daude, hurrenez hurren, eta XRCC4-DNA ligasa IV konplexuak DNA muturren ligadura estimulatzen du (Chatterjee et al., 2015). DNA muturren prozesatzeko entzima, polinukleotido kinasa 3'-fosfato gisa ere ezagutzen dena, DNA muturren prozesatzeko entzima bat da. DNAren 3'P taldea kendu eta 5'OH taldea fosforilatu dezake DSB konponketan zehar. Kate-hausturak (SSB) konpontzea ere barne hartzen du SSB konponketa bidea erabiliz (Chatterjee et al., 2015). DNA-PKc proteina kinasa DNAren menpeko proteina kinasa bat da, PIKKen (fosfatidilinositol 3-kinasa-erlazionatutako kinasak) eta ataxia telangiektasia mutatutako (ATM) familiaren azpiunitate katalitiko batez osatua, baita ATM eta Rad3-rekin erlazionatutako ATRez ere. Kate-hausturak (DSB) eta kate-hausturak (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR konponketa-mekanismo zehatzagoa eta egokiagoa da, informazioa DNA homologo duplexaren forma osorik erabiliz kopiatzen baita, nahiz eta kromatida arreben presentzia behar duen. Hau ugaztunen zelula-zikloaren S/G2 fasean gertatzen da. HDR batez ere legamia-espezieetan gertatzen da, baina NHEJ kritikoa da ugaztunengan (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Konponketa-mekanismo osoa 1. irudian ageri da.
TNBC anomalia genetiko eta epigenetikoek eragiten dutenez, CRISPR/Cas9 erabiliz genomiko/epigenomiko anomalia gaiztoak zuzentzea terapia-ikuspegi arrazoizkoa izan daiteke (Chen et al., 2019). Gainera, zelula-espezifiko transkripzio-erregulazioan parte hartzen duten transkripzio-faktore batzuek minbizi-zelulen ezaugarri bereziak erakuts ditzakete, eta horrek iradokitzen du transkripzio-erregulazioa minbiziaren tratamendurako ikuspegi bikaina izan daitekeela (Drost et al., 2017). Tumoreen ezaugarri molekular hauek, hala nola akats genetikoak, epigenetikoak eta transkripzionalak, botiken garapenerako erabiltzeak emaitza klinikoak hobetu eta bahetze-kostuak murriztu ditzake. CRISPR geneak editatzeko tresna potentziala da, minbizia eragiten duten helburu genomikoak detektatu eta identifikatu ez ezik, giza zeluletako onkogeneak editatzeko, kentzeko eta epigenetikoki aldatzeko ere erabil daitekeena (1. taula) (Ahmed et al., 2021). Hainbat CRISPR baheketa egin dira tumore-zapaltzaileekin, onkogeneekin eta botiken erresistentziarekin lotutako geneak bilatzeko. CRISPR/Cas9ren erabilera hainbat TNBC onkogene editatzeko 2. irudian ageri da.
2. irudia. CRISPR/Cas9 erabiliz hainbat TNBC onkogeneren geneen edizioa, tumoreen hazkundea eta metastasia murriztuz. Onkogene horien artean daude CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 eta CXCR7, Crypto1, ROR1 eta ST8SIA, TNBCren agerpenean eta metastasian parte hartzen dutenak.
Minbizi-zelulen migrazioa, inbasioa eta epitelio-mesenkima trantsizioa (EMT) ITGA9rekin lotuta daude. Aurreko ikerketek erakutsi dute ITGA9 Notch bideko jokalari gakoa dela eta rabdomiosarkomaren metastasian zeregin interesgarria betetzen duela (Molist et al., 2020). Gainera, ITGA9 hainbat tumore motatako pazienteen pronostikoarekin estuki lotuta dagoela ikusi da, bularreko minbizia barne (Wang Z. et al., 2019). Horrez gain, ITGA9ren bioinformatika-analisiak erakutsi zuen bere adierazpena TNBCn beste bularreko minbizi azpimota batzuetan baino nabarmen handiagoa zela. ITGA9 maila altuak tumoreen metastasiarekin eta errepikapenarekin lotuta daude TNBC pazienteetan. CRISPR/Cas9k ITGA9 kentzeko prozesuak minbizi-zelulen (CSC) antzeko propietateak, tumoreen angiogenesia, tumoreen hazkundea eta metastasia murriztua eragin zituen β-kateninaren degradazioa sustatuz TNBCn (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 TGF-β familiako kidea da eta funtsezkoa da enbrioi-genesi goiztiarrean, zelula amen mantentzean eta minbiziaren metastasian (Ishii et al., 2021). Tdgf-1 izenez ere ezaguna, GPI-an ainguratutako seinaleztapen-proteina onkogenikoa da, eta marra primitiboaren, mesodermoaren eta endodermoaren eraketaren erregulazioan parte hartzen du, baita gorputzeko organoen garapenean ezker/eskuin asimetria ezartzean ere, enbrioi-genesian zehar (Zhang et al., 2021b). Horrez gain, Cripto-1 zelula amen markatzaile gisa epitelio-mesenkima trantsizioan (EMT) parte hartzen duela frogatu da (Zhang et al., 2021b). EMT ez da soilik funtsezkoa hainbat prozesutan, hala nola enbrioiaren garapenean, fibrosian eta zaurien sendatzean, baita minbiziaren inbasioan eta metastasian ere. Gainera, Cripto-1ek lau Notch hartzailerekin elkarreragiten duela eta haien translazio osteko heltzea hobetzen duela frogatu da (Brandstadter eta Maillard, 2019). Notch seinaleztapen bideak gizakien bularreko minbizi-zelulen mantentzean parte hartzen duela jakina da. Ikerketek erakutsi dute CRISPR/Cas9 bidezko Crypto-1-en knockout-ak minbiziaren hazkuntza eta metastasia murrizten dituela. Beraz, Crypto-1 TNBC-ren helburu terapeutiko garrantzitsua bihur daiteke (Castro et al., 2015).
XCL12 proteinak eta bere kimiokina hartzaile CXC-k (CXCR4 eta CXCR7) hainbat rol jokatzen dituzte minbizi-zelulen ugalketa, hazkuntza, migrazioa eta inbasioan (Wu et al., 2015). Kimioterapia-hartzaile hauek TNBC-ren garapenarekin lotu dira seinaleztapen-bide ugarien bidez, bai in vivo bai in vitro ereduetan (Wu et al., 2015). Gainera, CXCR4 eta CXCR7-ren aktibazioa metastasiarekiko suszeptibilitate handiagoarekin eta pronostiko txarrarekin lotuta dago TNBC-n (Karn et al., 2022). Beraz, CXCR4 eta CXCR7-ren ezabatzea bularreko minbizia tratatzeko gene eraginkorrak izan daitezke, TNBC barne. Yang et al.-ek egindako ikerketak (2019) CRISPR/Cas9 erabili zuen CXCR4 eta CXCR7 geneak batera ezabatzeko, eta aurkitu zuten TNBC-ren ugalketa, hazkuntza, migrazioa eta inbasioa nabarmen inhibitzen zirela (Yang et al., 2019).
miR-3662-ren maila igoerak ikusi ziren bularreko minbizi-ehunetan, TNBC onkogene bat (Yi et al., 2022). miR-3662-ren murrizketak bularreko minbiziaren tumoreen hazkuntza eta metastasia inhibitzen dituela frogatu da bai in vivo bai in vitro (Agarwal eta Gupta, 2021). HBP-1 Wnt/-katenina seinaleztapenaren inhibitzaile indartsua da eta ziurrenik miR-3662-k bitartekatutako TNBC zelulen hazkuntzaren arduraduna da. Duela gutxi, Yi et al.-ek aurkitu zuten miR-3662-HBP1 ardatzak Wnt/-katenina seinaleztapen-bidea erregulatzen duela TNBC zeluletan (Yi et al., 2022). Tumore-espezifiko adierazpenagatik, miR-3662 TNBC-rako helburu terapeutiko potentziala izan daiteke. Beraz, CRISPR/Cas9-k bitartekatutako miR-3662-ren murrizketak ikuspegi bikaina izan daiteke TNBC tratatzeko sendagai berriak garatzeko.
UBR5 300 kDa-ko nukleofosfoproteina bat da, hainbat minbizi motatan tumoregenesiaren, metastasiaren eta immunitate-erantzunaren erregulatzaile gako gisa identifikatu dena (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Jakinarazi da UBR5 TNBC laginetan gora-betean erregulatuta dagoela eta ERα funtzioa estimulatzen duela ubikitina ligasa jardueraren bidez proliferazioa eraginez (Bolt et al., 2015). TNBC lagin primarioen exoma osoaren sekuentziazio-azterketek ere UBR5-en adierazpen handiagoa erakutsi zuten, TNBCren garapenean duen zeregina iradokiz. Horrez gain, CRISPR/Cas9-k eragindako UBR5-en ezabaketak TNBC metastasiaren eta hazkundearen inhibizio nabarmena erakutsi zuen sagu-eredu esperimentaletan. Gainera, UBR5 sagu-eredu basati batean sartzeak bere funtzionaltasun osoa berreskuratu zuen, efektu hori ez zen bitartean ikusi andui mutante inaktibatuetan (Liao et al., 2017). UBR5 falta apoptosiaren, nekrosiaren eta tumoreen hazkundearen inhibizioaren areagotzearekin lotuta dago TNBC-n, angiogenesi eskasaren ondorioz. UBR5 galeraren ondorioz, tumorearen hedapena organo urrunetara murrizten da, eta UBR5-ek EMT anormala eragiten du batez ere E-kaderinaren adierazpena murriztuz (Zhang eta Weinberg, 2018). Duela gutxi, UBR5 faktore oso garrantzitsua dela frogatu da IFN-γ-k eragindako PDL1 transkripzioan TNBC-n, E3 ubikitinazio jarduera falta duelako. RNA transkriptomaren analisiak agerian utzi du UBR5-ek IFN-γ bidearekin lotutako geneetan eragin sistemikoak izan ditzakeela eta PDL1 transaktibazioa sustatu dezakeela proteina kinasa RNA (PKR) eta bere seinale transduktore eta aktibatzaileen aktibazio mailak handituz. transkripzio 1 (STAT1) eta interferon erregulatzaile faktore 1 (IRF1). Hala ere, CRISPR/Cas9-k UBR5 eta PD-L1 espresioaren ablazio konbinatuak efektu terapeutiko sinergikoa du blokeo bakar batek baino, tumorearen mikroingurunean eragin sakonak dituelarik (Wu et al., 2022). Beraz, CRISPR/Cas9 tresna garrantzitsua izan daiteke UBR5 funtzioa inhibitzeko, eta horrela TNBC metastasia eta tumorearen hazkundea murrizteko.
ROR1 I motako proteina transmembrano bat da, minbizian eta enbrioiaren garapenean adierazten dena eta proteina onkofetal gisa identifikatu da (Nicholas Borcherding, 2014). Giza minbizi mota askoren portaera inbaditzailea ROR1-en erregulazio gorakorrarekin lotuta dago. Emaitza itxaropentsuak lortu dira ROR1-i zuzendutako konposatu terapeutikoak in vivo eta in vitro ikerketetatik (Chien et al., 2016). Bularreko ehunen biopsietan ROR1 mRNA-ren maila altuak bularreko tumore basal (BL) oldarkorrekin eta gorputzeko beste atal batzuetara migrazioarekin ere lotu dira. Gainera, ROR1-en gehiegizko adierazpena TNBC-ren garapenaren markatzaile prognostiko gisa identifikatu da (Chien et al., 2016). Hala ere, ROR1 isilaraztea CRISPR/Cas9 erabiliz TNBC-ren hazkuntza eta metastasia murrizteko estrategia eraginkorra litzateke.
Sialilazio prozesuak azido sialikoa glikokonjugatuei gehitzea dakar, eta hau sialiltransferasek (ST) katalizatzen dute. ST8SIA1 ST familiakoa da eta hainbat gaixotasunen patogenian paper garrantzitsua betetzen du, hala nola leuzemia linfozitikoa eta ondesteko minbizia (Chang et al., 2018). RNA sekuentziaren analisiak erakusten du ST8SIA1 oso adierazita dagoela TNBC pazienteen bularreko ehunean eta positiboki korrelazionatuta dagoela p53 tumore-zapaltzaile genearen mutazioekin, eta horrek TNBCren patogenian lagun dezake (Battula et al., 2017). Horrez gain, ST8SIA1 TNBCren metastasian eta berragerpenean parte hartzen du, eta horrek iradokitzen du paper garrantzitsua betetzen duela TNBCren agerpenean eta garapenean. TNBCren in vitro eredu batean, CRIPSR/Cas9-k ST8SIA1-en murrizketak hazkundea eta metastasia blokeatzen dituela frogatu da (Battula et al., 2017). Horrek iradokitzen du CRISPR/Cas9 tresna garrantzitsua izan daitekeela ST8SIA1 onkogenearen funtzioa inhibitzeko TNBCren tratamenduan.
NAT1 II faseko konposatu xenobiotikoen eraketa katalizatzen duen entzima metaboliko bat da eta ia giza ehun guztietan adierazten da. NAT1-ek folato kofaktorea erabil dezake azetil-CoA (azetil-CoA) helburu izateko, amina aromatikoaren substraturik ezean ere (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Ikerketek erakutsi dute NAT1-ek matrizearen metaloproteinasa 9 (MMP9) funtzioa erregulatzen duela bularreko minbizi-zelulen ereduetan eta oxigeno erreaktiboen espezieen (ROS) aurka babesten duela glukosa-gabeziaren garaian (Wang et al., 2018). NAT1-en ezabatzeak piruvato deshidrogenasa konplexua inhibitzen duela frogatu da, mitokondrioen disfuntzioa eraginez (Wang L. et al., 2019). Horrez gain, beste hainbat txostenek erakutsi dute molekula txikiak eta siRNA isiltzea erabiliz NAT1 inhibitzeak bularreko minbizi-zelulen inbasioa eta ugalketa murriztu ditzakeela (Stepp et al., 2018). Duela gutxi, CRISPR/Cas9 erabili zen NAT1 kentzeko MDA-MB-231 bularreko minbiziaren zelula-lerroan, zelulen metabolismoan eragina izanik bere adierazpen-mailaren arabera. Ikerketa honek ere erakutsi zuen NAT-1 funtsezkoa dela TNBCren progresio eta metastasirako (Carlisle et al., 2020).
Onkogeneen transkripzio koordinatua super-potentziatzaileek, transkripzio-faktoreek eta kofaktoreek erregulatzen dute (Hnisz et al., 2015). Horrez gain, ziklina-menpeko kinasa (CDK) talde bat beharrezkoa da transkripzio-erregulaziorako, hala nola CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 eta CDK13. Horien artean, CDK7 RNA polimerasa II-ren fosforilazioan parte hartzen du, eta hori oso garrantzitsua da TNBC-ren patogenesian onkogeneen transkripzioaren hasiera eta hedapenerako. Ikerketa garrantzitsu batean, CRISPR/Cas9-k CDK7 ezabatzeak TNBC inhibitzen zuen, eta horrek adierazten du TNBC-ren patogenesia CDK7-ren menpekoa dela (Wang Y. et al., 2015).
Ikerketek erakutsi dute MYC eta RBP-n (RNA lotzen duen proteina) mutazioek apoptosia eragin dezaketela, MYC edo RBP-n gene bakarreko mutazioek, berriz, ez dutela eragiten minbizi-zelulen hazkuntzan (Einstein et al., 2021). Giza genoman 1000 RBP baino gehiago aztertu dira CRISPR/Cas9 oinarritutako liburutegi bat erabiliz. Horien artean, 57 RBP funtsezkoak direla ikusi da MYC maila oso altua duten minbizi-zelulen hazkuntzarako (Wheeler et al., 2020). Gainera, YTHDF2 garrantzitsua da TNBC zelulen hazkuntza mantentzeko eta transkripzio metilatuen kopurua murrizten du transkripzio eta itzulpen maila altuan MYC espresio handiagoa duten minbizi-zeluletan. Gainera, YTHDF2 ez da ezinbestekoa minbizi-zelulentzat, MYC maila altuen menpe ez daudenak TNBC gaixoen biziraupena luzatzeko (Einstein et al., 2021), eta horrek iradokitzen du TNBC gaindi dezaketen sendagaien helburu terapeutiko potentziala izan daitekeela.
Zink hatz proteinek (ZNF) giza genoma osoaren % 1 inguru osatzen dute. Ikerketek erakutsi dute ZNF-k zelulen ugalketa erregulatu dezakeela hainbat minbizi motatan, hala nola gibeleko minbizian, bularreko minbizian eta ondesteko minbizian (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). CRISPR knockout bidez sortutako liburutegiak erabili dira bularreko minbizi-zeluletan tumore-zapaltzaile gene (TSG) desberdinak aztertzeko (Shalem et al., 2014). Ordutik, CRISPR/Cas9 ZNF319 ezabatutako bularreko minbizi-zelulen transkriptomikako ikerketa batek erakutsi du ZNF319 bularreko minbiziaren ugalketa murrizten duen tumore-zapaltzaile gene bat dela eta, beraz, hainbat seinaleztapen-mekanismo potentzialetan eta beste funtzio biologiko batzuetan parte hartzen duela (Wang L. et al., 2022).
Ferroptosia burdinaren presentziaren menpe dagoen zelula-heriotza programatu mota bat da. Jakina da ferroptosiaren garapena lipido peroxidoen presentziak eragiten duela. Gainera, PKCβII-k lipidoen peroxidazio goiztiarra erakusten duela jakinarazi da, eta lipidoen peroxidazio handiagoa ferroptosiarekin lotuta dago. CRISPR/Cas9-k bitartekatutako kinasa inhibitzaileen liburutegi bat aztertzeak agerian utzi zuen PKCβII lipidoen peroxidazio prozesuan parte hartzen duela, eta hori funtsezkoa da MDA-MB-231 zeluletan ferroptosian (Zhang et al., 2022). Beraz, honek iradokitzen du CRISPR/Cas9-k PKCβII-ren ezabatzea ferroptosiarekin lotutako gaixotasunen tratamendurako tumore-zapaltzaile geneen helburu potentziala izan daitekeela (Zhang et al., 2022).
Uste da erresistentzia sendagaiengan minbizia duten pazienteen heriotzen % 90 ingururen erantzule dela eta minbiziaren tratamenduko erronka nagusietako bat dela (Bukowski et al., 2020). Emaitzek adierazten dute sendagaien isurketarekin, DNAren konponketarekin, apoptosiarekin eta hainbat zelulen seinaleztapen biderekin lotutako gene kopuru nahikoa dagoela erresistentziarekin lotuta (Haider et al., 2020). Horien artean, hainbat gene CRISPR/Cas9 tresnen jomugan jarri dira eta emaitza itxaropentsuak erakutsi dituzte sendagaien erresistentzia murrizteko eta minbiziaren aurkako tratamenduen eraginkortasuna handitzeko (Vaghari-Tabari et al., 2022). Horrez gain, CRISPR/Cas9 geneen ezabatze-baheketa liburutegiek erresistentzia-gene potentzialen funtzioa aldatzearekin lotu dira (Shalem et al., 2015). Paclitaxel erresistentzia-geneak identifikatzeko, RNA sekuentziazioa eta genoma osoko sgRNA liburutegiaren baheketa erabili ziren zortzi hautagai-gene identifikatzeko, histona desazetilasa 9 (HDAC9) barne, TNBC errepikaria duten pazienteen erresistentziarekin lotuta daudenak (B et al., 2020). Beste ikerketa batean, diserina/treonina eta tirosina proteina kinasa (DSTYK) adierazpenaren igoera ikusi zen minbiziaren aurkako sendagaiekin tratatutako TNBC pazienteen biziraupenean. Gainera, CRISPR/Cas9-k eragindako DSTYK-ren knockdown-ak nabarmen handitu zuen sendagaiekiko erresistenteak diren minbizi-zelulen apoptosia in vitro (SUM102PT zelulak eta MDA-MB-468 zelulak) eta in vivo TNBC eredu batean (Ogbu et al., 2021).
TNBC-k MAPK bidearen aktibazio anormala badu ere, MEK-ri zuzendutako terapien efektu klinikoa eskasa da. CRISPR/Cas9 genomaren liburutegiaren baheketa batek agerian utzi zuen PSMG2-ren (proteomaren muntaketa-txaperona 2) inhibizioak TNBC BT549 eta MB468 zelulak AZD6244 MEK inhibitzailearekiko sentikortzen dituela. PSMG2-ren CRISPR/Cas9-ren knockdown-ak proteasomaren funtzio normala aldatu zuen, PDPK1-en autofagia bidezko desmuntaketa eraginez, eta horrela, AZD6244-k (MEK inhibitzailea) eta MG132-k (proteasoma inhibitzailea) eragindako TNBC sagu-ereduetako tumore-zelulak are gehiago hobetuz. Horrela, proteasoma eta MAP kinasa (MEK) inhibitzaileak sinergikoki administra daitezke tumore-zelulen ugalketa murrizteko (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 ere erabili izan da TNBC erresistentzia eragiten duen geneen funtzioaren galera detektatzeko (Shu et al., 2020). Ge et al.-ek JQ1-ekin, BET bromodominio inhibitzaile batekin (BBDI), tratatutako minbizi-zelulen erresistentziaren mekanismoa azaldu zuten TNBC-n. CRISPR/Cas9 erabiliz, aurkitu zuten rb1 genea ezabatzeak TNBC JQ1 minbiziaren aurkako sendagaiarekiko erresistente bihurtzen zuela. Beraz, rb1 funtzioa garrantzitsua da TNBC-n JQ1 sendagaien aurrean. Halaber, jakinarazi zuten paklitaxela CDK4/6 kinasa/mikrotubulu inhibitzaile bat dela, eta JQ1 bezalako BBDIekin konbinatzeak erantzun terapeutiko itxaropentsuak eman ditzakeela TNBC erresistenteei (Ge et al., 2020).
Jakinarazi da RNA luze ez-kodetzailearen (lncRNA) transkripzio-paisaia dela TNBC-n terapia neoadjuvantearekiko erresistentziaren erantzule. Ikerketa honek erakusten du bost MALAT1 lncRNA transkriptu desberdin TNBC-n oso adierazita daudela. Gainera, CRISPR/Cas9-k eragindako MALAT1 ezabatzeak TNBC BT-549 zelulen sentikortasuna handitu zuen paklitaxel eta doxorubizinarekiko, eta horrek iradokitzen du MALAT1 erresistentziak TNBC-n izan dezakeen zeregin potentziala (Shaath et al., 2021).
BRCA1-en (BRCA1m) mutazioak heterogeneoak dira eta, beraz, zailak dira detektatzen. PARP1 (poli(ADP-ribosa) polimerasa), BRCA1-en bikotekide hilgarri sintetikoa, helburu hartzeak TNBC sendagaien kimiosentsibilitatea handitu dezake. CRISPR/Cas9 erabiliz, PARP1 ezabatzeak minbiziaren aurkako sendagaien, hala nola doxorubicinaren, gemcitabinaren eta docetaxelaren, sentikortasuna handitu zuen mBRCA1 mutante TNBC zelulen aurrean, eta horrek iradokitzen du PARP1 ere TNBC-n sendagaien erresistentzian parte hartzen duela (Vaghari-Tabari et al., 2022). . BRCA1 edo BRCA2 tumore-zapaltzaile geneen mutazioek bularreko minbizia garatzeko probabilitatea handitzen dutela ezagutzen da pertsonengan. Paziente horien tratamenduak PARP inhibitzaileak erabiltzea eskatzen du. Gainera, frogatu da CRISPR/Cas9 erabiliz DNPH1 nukleotidoen berreskuratze faktorea ezabatzeak 5-hidroximetildesoxiuridina (hmdU) monofosfato nukleotido toxikoa ken dezakeela, eta horrela BRCA gabezia duten zelulen PARP inhibitzaileekiko sentikortasunarekiko erantzuna hobetzen duela (Fugger et al., 2021). Beraz, CRISPR/Cas9 eta PARP1 inhibitzaileak TNBCrako tratamendu estrategia garrantzitsu bihur daitezke.
Glikoproteina sarkorraren (P-gp) genea erresistentzia anitzeko gene bat da, eta, oro har, TNBC guztien % 41ean gutxi gorabehera gora egiten du (Sun et al., 2020). P-gp-k eragindako sendagaien isurketa bularreko minbizian sendagaien erresistentziaren erregulatzaile gako gisa identifikatu da. P-gp inhibitzaileek sentikortasun handiagoa erakutsi dute minbiziaren aurkako sendagaiekiko bularreko minbizian (Famta et al., 2021). Beraz, CRISPR/Cas9-k eragindako P-gp-ren eta P-gp inhibitzaileen ablazioa edo ezabapena oso metodo garrantzitsuak izan daitezke TNBC-n sendagaien erresistentzia gainditzeko.
ATP lotura duen G2 kasete garraiatzaileak (ABCG2) erresistentzia eragiten duela ezagutzen da TNBCn (Palasuberniam et al., 2015), nahiz eta oraingoz ez dagoen txostenik CRISPR/Cas9 eta ABCG2 isilaraztearen eta tumore-zapaltzaile geneen inaktibazioaren arteko erlazioari buruz. PTENek ABCG2 aktibazioa areagotu dezake (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Beraz, CRISP/Ca9 erabiltzea ABCG2 kentzeko eta ABCG2 inhibitzaile batekin konbinatzea tratamendu egokia izan daiteke TNBCn erresistentzia gainditzeko. 2. taulan CRISPR/Cas9 aipatzen da erresistentzia-gene guztiei zuzenduta.
2. taula. CRISPR/Cas9-k hainbat TNBC erresistentzia-generi erasotzen die zelulak minbiziaren aurkako sendagaiekiko sentikortzeko.
CRISPR/Cas9 liburutegiak minbiziaren patogenesiarekin lotutako gene-mutazioak bahetzeko tresna potentzialak dira (Chan et al., 2022). Bahetze-metodo honek lau urrats ditu: (a) liburutegiaren eraikuntza, (b) lentibirusen transdukzioa, (c) fenotipikoaren bahetzea eta (d) helburu-genearen analisia. TNBC-k MAPK bidearen aktibazio anormala badu ere, MEK zuzendutako terapiaren pronostiko klinikoa oso txarra da PTEN, RB1 eta TP53 bezalako tumore-zapaltzaile geneetan mutazioak dituzten TNBC gaixoentzat.
Gainera, CRISPR/Cas9 erabiliz egindako geneen ezabatze-baheketa batek molekularik indartsuena eta selektiboena, deshidrokatrol, probatu zuen, Guatemalako lore eta hosto-estraktuetan ugaria dena, deshidrokatrolak MDA-MB-231n duen eragina ulertzeko. Zelulen zitotoxikotasun selektiboaren mekanismoak. TNBC azpimoten zurtoin mesenkimalen ezaugarriak. CRISPR/Cas9 oinarritutako baheketa honek ere agerian utzi zuen HSD17B11, 11 motako 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa kodetzen duen genea, MDA-MB-231 zeluletan adierazten dela eta MDA-MB-231 zelulentzat espezifikoa deshidrofalkarinola sortzen duela (Grant et. al., 2020). Beraz, honek iradokitzen du CRISPR/Cas9 baheketa genomikoak potentzial handia duela konposatu naturalen minbiziaren aurkako propietateen oinarrian dauden mekanismoak identifikatzeko.
Horrez gain, TNBC-k minbiziarekiko duen ahultasuna aztertu zen in vivo CRISPR/Cas9 baheketa inpartzial bat erabiliz, eta horrek lotura erakutsi zuen bide onkogenikoen eta tumore-zapaltzaileen artean. mTOR eta Hippo bideen osagai gakoek zeregin garrantzitsua betetzen dutela jakinarazi da TNBC-n tumoreen erregulazioan. Horrez gain, ikerketek erakutsi dute mTORC1/2 eta YAP onkoproteinaren inhibizio farmakologikoak TNBC-ren patogenizitatea eraginkortasunez inhibitzen duela in vitro sendagai-matrize sinergia eredua eta in vivo pazienteengandik eratorritako xenografteak erabiliz. Gainera, Torin-1-ek eragindako mTORC1/2 inhibizioak makropinozitosia hobetzen du, verteporfinak eragindako YAP inhibizioak TNBC zelulen heriotza eragiten duen bitartean. Emaitza hauek guztiek in vivo CRISPR baheketaren indarra eta sendotasuna nabarmentzen dituzte TNBC-rako tratamendu berri eta eraginkorrak identifikatzeko (Dai et al., 2021).
Sistema immunitarioaren deserregulazioa tumore-genesian faktore garrantzitsua da. Minbizi-zelulek immunitate-garbiketa saihesten dute defentsa-mekanismoak saihestuz, besteak beste, tumore-mikroinguruneko zelula immunitarioen jardueran interferentziak eginez eta sistema immunitarioa arriskuan jarriz. Beraz, sistema immunitario hobetu bat garatzea funtsezko ikuspegia izan daiteke tumoreei aurre egiteko. CRISPR/Cas9 oinarritutako geneen aldaketaren erabilerak immunitate-disfuntzioarekin lotutako hainbat arazo jorratzen ditu ikuspegi desberdinetatik. CRISPR/Cas9 erabili da bularreko minbiziaren aurkako tumoreen aurkako immunitatea hobetzeko bide hauen bidez (3. irudia).
3. irudia. CRISPR/Cas9 immunoterapiak TNBC zelulak ditu jomugan. CDK5 galerak eta PDL1 eta CD155 gutxitzeak sistema immunologikoa hobetzen dute. Era berean, A2AR galerak eta HER2, muzina 1 eta TEM8 bezalako TAA gutxitzeak CAR-T zelulen eraginkortasuna handitu dute minbizi-zelulak hiltzeko. CRISPR/Cas9 bidezko T zelulen baheketak erakutsi du p38 kinasa etenak T zelulen tumoreen aurkako jarduera hobetzen duela. CRISPR/Cas9-k aldatutako T zelulek TCRren (T zelulen hartzailea) adierazpena handitzen dute, eta ondorioz, T zelulek tumoreen aurkako jarduera dute.
Immunoterapiaren helburua sistema immunologikoa minbizi-zelulak erasotzeko estimulatzea da. Kontrol-puntu immunologikoen proteinen gehiegizko adierazpenak erreakzio autoimmuneak saihesten ditu normalean, baina minbiziek horiek saihesteko lagun dezakete (Topalian et al., 2015). Proteina hauek erreakzio immunologikoak saihesten dituzte zelula immunologikoen gainazaleko hartzaileei lotuz. Kontrol-puntu proteina anitzek (CD155 eta PD-L1 bezalakoak) zelula immunologikoetako PD-1 hartzailea dute helburu eta bularreko minbizian adierazten dira, batez ere TNBCn (Li Y.-C. et al., 2020). PD-L1 edo bere hartzailearen ezabaketa CRISPR/Cas9 erabiliz sistema immunologikoa TNBC tumoreak erasotzeko estimula dezake (Yahata et al., 2019). Gainera, PD-L1 adierazpenaren beherakada, CRISPR/Cas9 bidez CDK5 ezabatzearen bidez, tumoreen hazkundea inhibitzen duela frogatu da in vitro eta in vivo (Deng et al., 2020). Bularreko minbiziaren in vitro eta in vivo ereduetan hazkuntza inhibitzeak iradokitzen du shRNA bidezko CD155 murrizketak eragin terapeutikoa izan dezakeela bularreko minbizian (Gao et al., 2018).
CAR T zelulek tumoreekin lotutako antigenoak (TAA) ezagutzen dituzten CARak adierazten dituzte eta kontrol-puntuko proteinen ezabapena erabil dezakete haien jarduera hobetzeko (Li C. et al., 2020). CAR T zelulen terapiarako hainbat helburu potentzial daude bularreko minbizian, besteak beste, hainbat TAA, hala nola HER2, muzina1 eta TEM8 (Bajgain et al., 2018). Froga dago mesotelina helburu duten CAR T zelulak (TNBC BT-459 zeluletan gehiegi adierazita) minbiziaren aurka eraginkorragoak direla PD-1 CRISPR/Cas9 erabiliz ezabatzen denean (Hu et al., 2019). Hala ere, pazienteengandik T zelulak isolatzea eta gero ex vivo editatzea lan-intentsiboa eta denbora asko eskatzen duen prozesua da. T zelula unibertsalek isolamendu-eskakizunak murriztu ditzaketen arren, I. klaseko giza leukozitoen antigenoa (HLA) eta T zelulen hartzailea (TCR) adierazten duten emaileen T zelulak kendu egin behar dira txertoaren aurkako ostalariaren anomaliak saihesteko (Ren et al., 2017). , 2017a). CRISPR/Cas9 erabiliz, HDR-k TCR eta HLA aldi berean ezaba ditzake eta CAR kodetzen duen genea ezaba dezake. Ikerketek erakutsi dute CRISPR/Cas9 erabil daitekeela CD19 aurkako CARak TCR lokusean sartzeko, eta horrela CARak eraginkortasunez ekoizteko T zelulak agortu gabe (Dimitri et al., 2022). Teknologia multiplexak garatu dira CAR T zelula alogenikoak sortzeko, TCR, beta-2-mikroglobulina (B2M), HLA-I azpiunitatea eta beste proteina batzuk, hala nola PD-1 eta CTLA-4, aldi berean ezabatuz, eta hauek minbiziaren aurkako propietate handiagoak izan ditzakete TNBCren aurka (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
CRISPR/Cas9 erabiltzeak CAR-T zelulen eraginkortasuna hobetu dezake. Adenosina propietate immunosupresoreak dituela ezagutzen da eta minbiziaren aurkako immunitatea murriztu dezake T zelulen funtzioa blokeatuz eta adenosina A2A hartzaileak (A2AR) aktibatuz (Vigano et al., 2019). CRISPR/Cas9 erabiliz A2AR isilarazteak CAR-T zelulen eraginkortasuna nabarmen hobetu zuen in vivo (Giuffrida et al., 2021). T zelulek hainbat ezaugarri fenotipiko erakusten dituztela ezagutzen da, hala nola zelulen hedapena, bereizketa, estres oxidatiboa eta estres genomikoa. CRISPR/Cas9 oinarritutako T zelulen baheketak 25 T zelulen hartzaile kinasa desberdinen etenaldia agerian utzi zuen. Horien artean, p38 kinasaren ezabaketak T zelulen tumoreen aurkako jarduera hobetzen duela frogatu da, eta horrek adierazten du p38 kinasa CAR-T zelulen erregulazioaren erregulatzaile nagusia dela (Gurusamy et al., 2020).
Zelula Tak genetikoki eraldatu daitezke CRISPR/Cas9 erabiliz, TCR oso adieraziak sortzeko. Genetikoki eraldatutako T zelulak pazienteei transferitzeak minbiziaren aurkako jarduera sendoagoa erakutsi du zelula T endogenoek baino. Beraz, TCR endogenoek lehiatu daitezke pazienteengan genetikoki aldatutako TCRekin, eta horrek minbiziaren immunoterapiaren potentzialean eragina izan dezake. Arazo hau gainditzeko, CRISPR/Cas9 erabiltzeak zelula hartzaileetan TCR-β endogenoa kentzeko eta ondoren TCR-β T zelulak minbizi gaixoei transferitzeko minbiziaren aurkako immunitate-erantzun hobeak erakuts ditzake, TCR endogenoen sexu-lehiaketaren beharrik gabe (Fan et al. 2018). Beraz, CRISPRz aldatutako T zelulak izan ezik, TCRak mila aldiz sentikorragoak dira tumore-antigenoekiko TCRz transduzitutako T zelula normalak baino. Gainera, hainbat leuzemiatan, γδ TCR+ CRISPRz sortutako T zelula aldatuek CD4+ eta CD8+ T zelulen adierazpen handiagoa erakusten dute TCR transferentzia estandarra baino (Legut et al., 2018). Beraz, CRISPR/Cas9-k sortutako T zelula eraldatuak TNBC gainditzeko immunoterapia metodo eraginkorra izan daitezke.
Integrinak zelulen transmintzetan dauden zelulen atxikimendu molekulak dira, eta zelulen matrize estrazelularrarekiko (ECM) lotura sustatzen dute (Hamidi eta Ivaska, 2018). Integrinen deserregulazioa minbiziaren garapenarekin eta migrazioarekin lotuta dago, matrize estrazelularra aldatuz, eta horrek minbizi-zelulen biziraupena eragiten du zirkulazioan (Hamidi eta Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-k eragindako integrina-gutxitzeak tumorearen progresioa, metastasia eta kolonizazioa moteltzen ditu TNBC-n. Integrina a5-en (ITGA5) gutxitzeak zelulen migrazioa eta progresioa murrizten dituela jakinarazi da beste minbizi batzuetan, hala nola biriketako minbizian (Ju et al., 2017), eta horrek iradokitzen du integrina a5 ere faktore gakoa izan daitekeela TNBC-ren patogenesian.
Enbrioi-zelulen metodo tradizionalak erabiliz knockout saguak sortzea lan-intentsiboa, denbora asko eskatzen duen prozesua eta eraginkorra ez dena da. Hilabeteak eta urteak behar dira zelula ESak birkonbinazio homologoaren bidez bideratzeko, sagu kimerikoak hazteko eta gero sagu heterozigotoekin gurutzatzeko ondorengo homozigotoak sortzeko. Gurutzaketa konplexua behar da mutazio genetiko anitz dituzten saguak sortzeko. Hala ere, arazo asko sortu dira CRISPR/Cas9 erabiliz zelula ES zelulen ablazioaren bidez edo CRISPR/Cas9 osagaiak zelula bakarreko arrautza ernalduetan mikroinjektatuz sortutako saguak erabiltzean. Adibidez, aldaketak sartzea askotan lokus bialelikoetan gertatzen da eta ez da gene espezifikoa. Duela gutxi jakinarazi da CRISPR/Cas9 teknologia erabiltzen duten zelula ES zelulek aldi berean mutazio bialelikoak txerta ditzaketela gehienez 5 genetan (Nishizono et al., 2021). Horretarako, Cas9 mRNA eta bost gene espezifikoko gRNA aldi berean transfektatu ziren zelula ESetan. Honek prozedura honen etorkizuna eta eraginkortasuna azpimarratzen ditu, nahiz eta mutazio hauek heredatu egin zitezkeen sortzaile-lerroak boskoitz knockout saguak sortzeko hazten zirenean. Ikerketak aurkikuntza harrigarri baten berri ere ematen du: ez dira gehiago beharrezkoak ES zelulak genetikoki eraldatutako saguak sortzeko. Horren ordez, gene-produktu espezifikoak kentzeko, Cas9 mRNA eta gRNA injektatu ziren zelula bakarreko faseko enbrioietan. Ondorioz, knockout sortzaile-lerroak sortu dira, eta teorian erabil daitezke saguetan gene-ezabatzearen ondorioak aztertzeko (Qin et al., 2016). Horrela, CRISPR/Cas9-k sagu transgenikoak sortzea ahalbidetzen du TNBC tratatzeko, ingeniaritza genetiko tradizionala baino kostu txikiagoan. CRISPR/Cas sistema erabiliz, knockout sagu-eredu berri bat garatu da, TNBC-ko gene endogeno bat edo gehiagotan puntu-mutazioak arrakastaz sar ditzakeena. Kontzeptu honetan oinarrituta, TNBCren animalia-ereduak ere garatu daitezke BRCA1 eta p53 CRISPR/Cas9 bidezko ezabapena erabiliz, eta horrek HR konponketaren galera, ezegonkortasun genomikoa eta fenotipo mutanteak eragiten ditu (Annunziato et al., 2020).
Gaur egun, hainbat metodo erabiltzen dira TNBC diagnostikatzeko, hala nola mamografia, erresonantzia magnetikoaren irudia (MRI) eta ultrasoinuak. Hala ere, metodo hauek muga batzuk dituzte. Mamografia bularreko ehun lokala diagnostikatzeko erabiltzen da, metastasiak baino gehiago, non minbizi-zelulak beste organo batzuetara migratu diren. Ultrasoinua ez da metodo fidagarria TNBC diagnostikatzeko (Chen eta Lee-Felker, 2023). MRIak ultrasoinuak eta mamografiak baino sentikortasun handiagoa du, baina bere diagnostiko-zehaztasuna mugatua da (Sha eta Chen, 2022). Ehunen biopsia minbizi-zelulak identifikatzeko modu inbaditzailea da. Hala ere, kasu batzuetan, biopsia batek ehun kantzerigenoa gal dezake orratza intereseko eremutik aldentzen bada. Gainera, oso garestia da eta traumatikoa izan daiteke pazientearentzat. TNBC minbizi mota heterogeneoa da, beraz, biopsiak ez du informazio nahikorik emango minbizi motari buruz. Hori dela eta, premiazkoa da TNBC detektatzeko diagnostiko fidagarriko metodo berri bat. CRISPR/Cas9 bularreko minbizia diagnostikatzeko alternatiba oso sentikorra eta gutxieneko inbaditzailea izan daiteke. Horretarako, CRISPR/Cas9 oinarritutako estrategiak erabil daitezke TNBC diagnostikatzeko PCR metodoak hobetzeko. Lehenik, CRISPR sistemaren Cas9 eta cpf1 proteinak erabiltzen dira DNA ez-espezifikoa kentzeko, eta ondoren bi proteina hauek (Cas9 eta cpf1) PAM sekuentzia ezagutu dezakete DNA helburura lotu aurretik (Deepak Singh et al., 2021). Horrela, PCR-k minbiziaren garapenarekin lotutako mutazioak identifikatu ditzake. Hainbat ikerketek CRISPR oinarritutako estrategia hau hartu dute minbizi desberdinetan mutazio desberdinak detektatzeko (Safari et al., 2019). Horrela, CRISPR oinarritutako PCR metodoek TNBC diagnostikoaren menpekotasuna murriztu dezakete biopsian oinarritutako immunohistokimika bezalako metodo inbaditzaileekiko.
Hormona-hartzaileen erregulazioan aldaketa genotipikoak ere frogatu dira TNBC-n (Chen eta Russo, 2009). CRISPR/Cas9-n oinarritutako PCR estrategiek, arreta-puntuko diagnostikoetarako mikroarrayak erabiliz, mutazio horiek eraginkortasunez monitoriza ditzakete (Hajian et al., 2019). Osasun-hornitzaileei TNBC pazienteen mutazio espezifikoei buruzko informazio garrantzitsua ere eman diezaieke, eta horrek haien tratamendua hobetzen lagun dezake. Hala ere, teknika konbinatu honek mugak ditu. Beraz, ikerketa-ahalegin handiak behar dira CRISPR/Cas-PCR metodo hau osasun-arloan TNBC diagnostikatzeko erabili ahal izateko (Yang et al., 2019).
Argitaratze data: 2024ko urriaren 14a