Konputaziozko tomografia bidez (CT) identifikatutako biriketako noduluen diagnostiko diferentziala erronka bat izaten jarraitzen du praktika klinikoan.Hemen, 480 serum laginen metaboloma globala ezaugarritzen dugu, kontrol osasuntsuak, biriketako nodulu onberak eta I. faseko biriketako adenokarcinoma barne.Adenokartzinomek profil metabolomiko berezia erakusten dute, nodulu onberak eta gizabanako osasuntsuek antzekotasun handia dute profil metabolomikoetan.Aurkikuntza taldean (n = 306), 27 metabolito multzo bat identifikatu zen nodulu onberak eta gaiztoak bereizteko.Eredu diskriminatzailearen AUC barne balioztatzea (n = 104) eta kanpoko balioztapena (n = 111) taldeetan 0,915 eta 0,945 izan zen, hurrenez hurren.Ibilbidearen analisiak biriketako adenokartzinomaren serumean triptofano gutxitzearekin lotutako metabolito glikolitikoak handitu egin ziren nodulu onberekin eta kontrol osasuntsuekin alderatuta, eta triptofanoaren hartzeak biriketako minbizi-zeluletan glukolisia sustatzen duela iradoki zuen.Gure ikerketak serum metabolitoen biomarkatzaileen balioa nabarmentzen du CT bidez detektaturiko biriketako noduluen arriskua ebaluatzeko.
Diagnostiko goiztiarra ezinbestekoa da minbizia duten gaixoen biziraupen-tasak hobetzeko.US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) eta European NELSON Study-ren emaitzek frogatu dute dosi baxuko tomografia konputazionalarekin (LDCT) baheketak nabarmen murrizten duela biriketako minbiziaren heriotza arrisku handiko taldeetan1,2,3.Biriketako minbiziaren baheketarako LDCT erabilera hedatu zenetik, biriketako nodulu sintomatikoen gertakari erradiografikoen intzidentzia handitzen joan da 4 .Biriketako noduluak 3 cm-ko diametroa duten opakutasun foku gisa definitzen dira 5 .Zailtasunak ditugu gaiztoa izateko probabilitatea ebaluatzeko eta LDCTn kasualitatez detektatu diren biriketako nodulu kopuru handiari aurre egiteko.CT-aren mugak maiz jarraipen-azterketak eta emaitza positibo faltsuak ekar ditzake, beharrezkoak ez diren esku-hartzeak eta gehiegizko tratamenduak6.Hori dela eta, biomarkatzaile fidagarriak eta erabilgarriak garatu beharra dago biriketako minbizia behar bezala identifikatzeko hasierako faseetan eta hasierako detekzioan nodulu onberak gehien bereizteko 7 .
Odolaren (seruma, plasma, odol periferikoko zelula mononuklearrak) analisi molekular osoak, genomika, proteomika edo DNAren metilazioa barne8,9,10, biriketako minbiziaren biomarkatzaile diagnostikoen aurkikuntzaren interesa areagotzea eragin du.Bien bitartean, metabolomikaren ikuspegiek ekintza endogenoek eta exogenoek eragina duten azken produktu zelularrak neurtzen dituzte eta, beraz, gaixotasunaren agerpena eta emaitza aurreikusteko aplikatzen dira.Kromatografia likido-tandem masa-espektrometria (LC-MS) metabolomika azterketetarako oso erabilia den metodoa da, bere sentsibilitate handia eta sorta dinamiko handia duelako, propietate fisikokimiko desberdinak dituzten metabolitoak estal ditzakeelako11,12,13.Biriketako minbiziaren diagnostikoarekin14,15,16,17 eta tratamenduaren eraginkortasunarekin lotutako biomarkatzaileak identifikatzeko plasma/serumaren analisi metabolomiko globala erabili bada ere,18 serum metabolitoen sailkatzaileak biriketako nodulu onberak eta gaiztoak bereizteko asko ikertu behar dira.-Ikerketa masiboa.
Adenokartzinoma eta zelula ezka-zelulen kartzinoma dira zelula ez-txikietako biriketako minbiziaren (NSCLC) bi azpimota nagusiak.CT baheketa proba ezberdinek adierazten dute adenokartzinoma biriketako minbizi mota histologiko ohikoena dela1,19,20,21.Azterketa honetan, ultra-errendimendu likidoaren kromatografia-bereizmen handiko masa-espektrometria (UPLC-HRMS) erabili dugu metabolomika-analisia egiteko guztira 695 serum-lagintan, kontrol osasuntsuak, biriketako nodulu onberak eta CT-k detektatutako ≤3 cm barne.Biriketako I. faseko adenokartzinomaren baheketa.Biriketako adenokartzinoma nodulu onberetatik eta kontrol osasuntsuetatik bereizten duten serum metabolitoen panel bat identifikatu genuen.Bide aberasteko analisiak agerian utzi zuen triptofanoa eta glukosaren metabolismo anormalak biriketako adenokartzinomaren ohiko alterazioak direla, nodulu onberak eta kontrol osasuntsuekin alderatuta.Azkenik, espezifikotasun eta sentsibilitate handiko serum-sailkatzaile metaboliko bat ezarri eta balioztatu dugu LDCT-k detektatzen dituen biriketako nodulu gaiztoak eta onberak bereizteko, diagnostiko diferentzial goiztiarra eta arriskuen ebaluazioa lagun dezakeena.
Oraingo ikerketan, sexuaren eta adinaren araberako serum-laginak atzera begira bildu ziren 174 kontrol osasuntsu, 292 biriketako nodulu onberak dituzten eta 229 biriketako I estadioko adenokarcinoma.695 irakasgaien ezaugarri demografikoak 1. taula osagarrian agertzen dira.
1a irudian erakusten den bezala, guztira 480 serum lagin bildu ziren Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbiziaren Zentroan, 174 kontrol osasuntsu (HC), 170 nodulu onberak (BN) eta 136 biriketako adenokartzinoma (LA) faseko lagin barne.Helbururik gabeko profil metabolomikorako aurkikuntza-kohortea errendimendu handiko kromatografia likidoa-bereizmen handiko masa-espektrometria (UPLC-HRMS) erabiliz.1. irudi osagarrian erakusten den moduan, LA eta HC, LA eta BN arteko metabolito diferentzialak identifikatu ziren sailkapen-eredu bat ezartzeko eta bideen analisi diferentziala gehiago aztertzeko.Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbiziaren Zentroak bildutako 104 lagin eta beste bi ospitalek bildutako 111 laginei barne eta kanpoko balioztapena egin zitzaien, hurrenez hurren.
a Serum metabolomika globalaren analisia egin duen aurkikuntza-kohortearen azterketa-populazioa ultra-errendimendu likidoaren kromatografia-bereizmen handiko masa-espektrometria (UPLC-HRMS) erabiliz.b Azterketa kohorteko 480 serum laginen metabolomaren guztizko metabolomaren karratu txikienen analisi partziala (PLS-DA), kontrol osasuntsuak (HC, n = 174), nodulu onberak (BN, n = 170) eta I. faseko biriketako adenokartzinoma barne. (Los Angeles, n = 136).+ESI, elektrospray ionizazio modu positiboa, -ESI, elektrospray ionizazio modu negatiboa.c–e Emandako bi taldetan ugaritasun nabarmen desberdinak dituzten metabolitoak (bi isatseko Wilcoxon sinatutako mailaren proba, aurkikuntza-tasa faltsuaren doitutako p balioa, FDR <0,05) gorriz (aldaketa > 1,2) eta urdinez (aldaketa <0,83) agertzen dira. .) sumendiaren grafikoan ageri da.f Clustering bero-mapa hierarkikoa, LA eta BN-ren artean komentatu diren metabolitoen kopuruan desberdintasun handiak erakusten dituena.Iturburu-datuak iturburu-datuen fitxategien moduan ematen dira.
Aurkikuntza taldeko 174 HC, 170 BN eta 136 LAren serum metaboloma osoa UPLC-HRMS analisia erabiliz aztertu zen.Lehenik eta behin, kalitate-kontroleko (QC) laginak gainbegiratu gabeko osagai nagusien analisiaren (PCA) eredu baten erdian estu biltzen direla erakusten dugu, egungo azterketaren errendimenduaren egonkortasuna baieztatuz (2. irudi osagarria).
1 b irudiko karratu txikienen arteko bereizketa partzialeko analisian (PLS-DA) erakusten den moduan, LA eta BN, LA eta HCren artean desberdintasun argiak zeudela ikusi dugu elektrospray ionizazio modu positiboan (+ESI) eta negatiboan (-ESI). .isolatuta.Hala ere, ez da desberdintasun esanguratsurik aurkitu BN eta HCren artean +ESI eta -ESI baldintzetan.
LA eta HCren arteko 382 ezaugarri diferentzial aurkitu ditugu, LA eta BN arteko 231 ezaugarri diferentzial eta BN eta HCren arteko 95 ezaugarri diferentzial (Wilcoxon-en sinatutako rank test, FDR <0,05 eta aldaketa anitzak >1,2 edo <0,83) (.1c-e irudia )..Pikuak gehiago ohartarazi ziren (Datu osagarriak 3) datu-base baten aurka (mzCloud/HMDB/Chemspider liburutegia) m/z balioaren, atxikipen-denboraren eta zatiketaren masa-espektroaren bilaketaren arabera (Metodoak atalean deskribatutako xehetasunak) 22 .Azkenik, ugaritasunaren alde esanguratsuak dituzten 33 eta 38 metabolito identifikatu ziren LA versus BN (1f irudia eta 2. taula osagarria) eta LA versus HC (3. irudi osagarria eta 2. taula osagarria), hurrenez hurren.Aitzitik, ugaritasunean desberdintasun esanguratsuak dituzten 3 metabolito baino ez ziren identifikatu BN eta HCn (2. Taula Osagarria), PLS-DAn BN eta HCren arteko gainjartzearekin bat.Metabolito diferentzial hauek produktu biokimiko ugari estaltzen dituzte (4. irudi osagarria).Batera hartuta, emaitza hauek biriketako minbiziaren hasierako fasearen eraldaketa gaiztoa islatzen duten serum metabolomaren aldaketa garrantzitsuak erakusten dituzte biriketako nodulu onberekin edo gai osasuntsuekin alderatuta.Bien bitartean, BN eta HCren serum metabolomaren antzekotasunak iradokitzen du biriketako nodulu onberak ezaugarri biologiko asko parteka ditzaketela pertsona osasuntsuekin.Hazkunde epidermikoko faktorearen hartzailearen (EGFR) geneen mutazioak biriketako adenokartzinomaren 23. azpimotan ohikoak direla kontuan hartuta, gidariaren mutazioek serum metaboloman duten eragina zehaztu nahi izan dugu.Ondoren, biriketako adenokartzinoma taldean EGFR egoera duten 72 kasuren profil metabolomiko orokorra aztertu dugu.Interesgarria da EGFR paziente mutanteen (n = 41) eta EGFR basatiaren pazienteen (n = 31) arteko profil konparagarriak aurkitu ditugu PCA analisian (5a irudi osagarria).Hala eta guztiz ere, EGFR mutazioa duten pazienteetan haien ugaritasuna nabarmen aldatu zen 7 metabolito identifikatu genituen EGFR basatia duten pazienteekin alderatuta (t proba, p <0.05 eta tolestura aldaketa> 1.2 edo <0.83) (5b irudi osagarria).Metabolito hauetako gehienak (7tik 5) azilkarnitinak dira, gantz-azidoen oxidazio-bideetan paper garrantzitsua betetzen dutenak.
2 a. Irudian erakusten den lan-fluxuan erakusten den bezala, noduluen sailkapenerako biomarkatzaileak gutxieneko uzkurtze-operadoreak erabiliz lortu ziren eta LA-n (n = 136) eta BN-n (n = 170) identifikatutako 33 metabolito diferentzialetan oinarritutako hautaketa erabiliz.Aldagaien konbinazio onena (LASSO) - erregresio logistikoko eredu bitarra.Hamar aldiz baliozkotze gurutzatua erabili zen ereduaren fidagarritasuna probatzeko.Aldagaien hautapena eta parametroen erregularizazioa λ24 parametroarekin probabilitate-maximizazio zigor baten bidez doitzen dira.Metabolomika globalaren analisia independenteki egin zen barneko baliozkotze (n = 104) eta kanpoko baliozkotze (n = 111) taldeetan, eredu diskriminatzailearen sailkapenaren errendimendua probatzeko.Ondorioz, aurkikuntza-multzoko 27 metabolito identifikatu ziren batez besteko AUC balio handiena zuten eredu diskriminatzailerik onena (2b. irudia), horien artean 9k jarduera handitu zuten eta 18k jarduera gutxitu zuten LAn BNrekin alderatuta (2c. irudia).
Biriketako noduluen sailkatzaile bat eraikitzeko lan-fluxua, aurkikuntza multzoko serum metabolitoen panel onena hautatzea barne, erregresio logistiko bitar eredu bat erabiliz, hamar aldiz baliozkotze gurutzatuaren bidez eta barneko eta kanpoko baliozkotze multzoetan aurreikuspen-errendimendua ebaluatuz.b Biomarkatzaile metabolikoen hautapenerako LASSO erregresio-ereduaren baliozkotze gurutzatuaren estatistikak.Goian emandako zenbakiek λ jakin batean hautatutako biomarkatzaileen batez besteko kopurua adierazten dute.Puntudun marra gorriak dagokion lambdan batez besteko AUC balioa adierazten du.Errore-barra grisek AUC balio minimoak eta maximoak adierazten dituzte.Puntu-lerroak aukeratutako 27 biomarkatzailerekin eredurik onena adierazten du.AUC, hartzailearen funtzionamendu-ezaugarriaren (ROC) kurbaren azpiko azalera.c Hautatutako 27 metabolitoen aldaketak tolestu LA taldean aurkikuntza taldeko BN taldearekin alderatuta.Zutabe gorria - aktibazioa.Zutabe urdina gainbehera da.d–f Hargailuaren funtzionamendu-ezaugarri (ROC) kurbak, 27 metabolito-konbinazioetan oinarritutako eredu diskriminatzailearen potentzia erakusten dutenak aurkikuntza, barne eta kanpoko baliozkotze multzoetan.Iturburu-datuak iturburu-datuen fitxategien moduan ematen dira.
Iragarpen-eredu bat sortu zen 27 metabolito horien erregresio-koefiziente haztatuetan oinarrituta (3. taula osagarria).27 metabolito hauetan oinarritutako ROC analisiak 0,933ko kurbaren (AUC) balioaren azpiko eremua eman zuen, aurkikuntza taldearen sentikortasuna 0,868 zen eta espezifikotasuna 0,859 (2d. irudia).Bien bitartean, LA eta HCren arteko 38 metabolito diferentzial annotatuen artean, 16 metabolito multzo batek 0,902ko AUC bat lortu du 0,801eko sentikortasunarekin eta 0,856ko espezifikotasunarekin LA bereiztea HCtik (6a-c irudi osagarria).Metabolito diferentzialen tolestura-aldaketaren atalase desberdinetan oinarritutako AUC balioak ere alderatu ziren.Sailkapen-eredua LA eta BN (HC) arteko bereizketarik onena izan zela ikusi genuen tolestura-aldaketa maila 1.2 versus 1.5 edo 2.0-n ezarri zenean (7a, b irudi osagarria).Sailkapen-eredua, 27 metabolito taldetan oinarritutakoa, barneko eta kanpoko kohorteetan balioztatu zen.AUC 0,915 (sentsibilitatea 0,867, espezifikotasuna 0,811) barne balioztatzerako eta 0,945 (sentsibilitatea 0,810, espezifikotasuna 0,979) kanpoko balioztapenerako (2e, f. irudia).Laborategien arteko eraginkortasuna ebaluatzeko, kanpoko kohorteko 40 lagin aztertu ziren kanpoko laborategi batean, Metodoak atalean azaltzen den moduan.Sailkapenaren zehaztasunak 0.925eko AUC lortu zuen (8. irudi osagarria).Biriketako zelula ezkatadunen kartzinoma (LUSC) biriketako adenokartzinomaren (LUAD) atzetik zelula ez-txikietako minbiziaren (NSCLC) bigarren azpimota ohikoena denez, profil metabolikoen balizko baliagarritasuna ere probatu dugu.BN eta 16 LUSC kasu.LUSC eta BN arteko diskriminazioaren AUC 0,776koa izan zen (9. irudi osagarria), LUAD eta BNren arteko diskriminazioarekin alderatuta, gaitasun eskasagoa adierazten du.
Ikerketek frogatu dute CT irudietako noduluen tamaina positiboki erlazionatuta dagoela gaiztoa izateko probabilitatearekin eta noduluen tratamenduaren determinatzaile nagusia izaten jarraitzen duela25,26,27.NELSON baheketa-azterketaren kohorte handiaren datuen analisiak erakutsi zuen nodoak <5 mm-ko subjektuetan gaiztotasun arriskua nodorik gabeko subjektuetakoaren antzekoa zela 28 .Hori dela eta, CT monitorizazio erregularra eskatzen duen gutxieneko tamaina 5 mm-koa da, British Thoracic Society-k (BTS) gomendatzen duen moduan, eta 6 mm-koa, Fleischner Society-k gomendatzen duen moduan 29 .Hala ere, 6 mm-tik gorako noduluek eta ageriko ezaugarri onberak ez dituztenak, biriketako nodulu zehaztugabeak (IPN) izenekoak, erronka handia izaten jarraitzen dute praktika klinikoan ebaluazioan eta kudeaketan30,31.Ondoren, noduluen tamainak sinadura metabolomikoan eragina izan duen aztertu dugu aurkikuntzako eta barne baliozkotze kohorteetako lagin bateratuak erabiliz.Balidatutako 27 biomarkatzailetan zentratuz, HC eta BN azpi-6 mm-ko metabolomen PCA profilak alderatu genituen lehenik.HC eta BN-ren datu-puntu gehienak gainjarri zirela ikusi genuen, serum metabolitoen mailak bi taldeetan antzekoak zirela frogatuz (3a. irudia).Tamaina-tarte ezberdinetako ezaugarrien mapak BN eta LAn mantendu ziren (3b, c irudia), 6-20 mm-ko nodulu gaiztoen eta onberen artean bereizketa bat ikusi zen (3d. irudia).Kohorte honek 0,927ko AUC, 0,868ko espezifikotasuna eta 0,820ko sentsibilitatea 6 eta 20 mm bitarteko noduluen gaiztotasuna aurreikusteko (3e, f. irudia).Gure emaitzek erakusten dute sailkatzaileak eraldaketa gaizto goiztiarrak eragindako aldaketa metabolikoak har ditzakeela, noduluaren tamaina edozein dela ere.
ad Zehaztutako taldeen arteko PCA profilen konparaketa, 27 metabolitoren sailkapen metaboliko batean oinarrituta.CC eta BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6-20 mm.LA 6-20 mm versus LA 20-30 mm.g BN 6-20 mm eta LA 6-20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6-20 mm, n = 91;LA 6-20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Hargailuaren funtzionamendu-ezaugarri (ROC) kurba eredu diskriminatzailea 6–20 mm-ko noduluetarako errendimendua erakusten duena.f Probabilitate-balioak 6-20 mm-ko noduluen erregresio logistikoaren ereduan oinarrituta kalkulatu ziren.Puntudun marra grisak ebaketa-balio optimoa adierazten du (0,455).Goiko zenbakiek Los Angelesen aurreikusitako kasuen ehunekoa adierazten dute.Erabili bi isatseko Student-en t proba.PCA, osagai nagusien analisia.AUC eremua kurbaren azpian.Iturburu-datuak iturburu-datuen fitxategien moduan ematen dira.
Biriketako noduluen antzeko tamainak dituzten lau lagin (44-61 urte bitartekoak) (7-9 mm) gehiago aukeratu ziren proposatutako gaiztoen iragarpen-ereduaren errendimendua erakusteko (4a, b. irudiak).Hasierako baheketan, 1. kasua kaltzifikazioarekin nodulu solido gisa aurkeztu zen, onberatasunarekin lotutako ezaugarri bat, eta 2. kasua, berriz, ezaugarri onberak ez zituen partzialki solido zehaztugabe gisa aurkeztu zen.Jarraipeneko CT-ko hiru errondak frogatu zuten kasu hauek egonkor mantentzen zirela 4 urteko epean eta, beraz, nodulu onberak hartzen zirela (4a. irudia).Serieko CT eskaneen ebaluazio klinikoarekin alderatuta, tiro bakarreko serum metabolitoen analisiak egungo sailkatzaile-ereduarekin azkar eta zuzen identifikatu zituen nodulu onberak murriztapen probabilistikoetan oinarrituta (1. taula).4b irudiak 3. kasuan, pleura-erretrakzio seinaleak dituen nodulu bat erakusten du, gehienetan gaiztotasunarekin lotzen dena32.4. kasua nodulu partzialki solido zehaztugabe gisa aurkeztu da, kausa onberaren frogarik gabe.Kasu hauek guztiak gaiztoak zirela aurreikusi ziren sailkatzaile-ereduaren arabera (1. taula).Biriketako adenokartzinomaren ebaluazioa biriketako erresekzio ebakuntzaren ondoren azterketa histopatologikoaren bidez frogatu zen (4b. irudia).Kanpoko baliozkotze multzorako, sailkatzaile metabolikoak zehaztasunez aurreikusi zituen 6 mm baino handiagoak diren biriketako nodulu zehaztugabeen bi kasu (10. irudi osagarria).
Nodulu onberaren bi kasuren biriketako leiho axialaren CT irudiak.1. kasuan, 4 urte igaro ondoren, 7 mm-ko nodulu solido egonkor bat erakutsi zuen eskuineko beheko lobuluan kaltzifikazioarekin.2. kasuan, 5 urte igaro ondoren, 7 mm-ko diametroa duen nodulu egonkorra eta partzialki solidoa aurkitu zuen eskuineko goiko lobuluan.b Biriketako leiho axialaren CT irudiak eta dagozkion azterketa patologikoak I. estadioko adenokartzinomaren bi kasuren biriketako erresekzioaren aurretik.3. kasuak eskuineko goiko lobuluan 8 mm-ko diametroa duen nodulu bat agerian utzi zuen pleura-erretrakzioarekin.4. kasuak ezkerreko goiko lobuluan 9 mm neurtzen zituen beirazko nodulu partzialki solidoa agerian utzi zuen.Birika-ehun erresekatutako hematoxilina eta eosina (H&E) tindaketa (eskala barra = 50 μm) biriketako adenokartzinomaren hazkuntza-eredu azinarra erakusten du.Geziek CT irudietan atzemandako noduluak adierazten dituzte.H&E irudiak patologoak aztertutako hainbat (>3) eremu mikroskopikoren irudi adierazgarriak dira.
Batera hartuta, gure emaitzek erakusten dute serum metabolitoen biomarkatzaileen balio potentziala biriketako noduluen diagnostiko diferentzialean, eta horrek erronkak sor ditzake CT baheketa ebaluatzean.
Metabolito diferentzialaren panel balioztatu batean oinarrituta, aldaketa metaboliko nagusien korrelazio biologikoak identifikatu nahi izan ditugu.MetaboAnalyst-ek egindako KEGG bide-aberaste-analisiak bi taldeen artean nabarmen aldatutako 6 bide komun identifikatu zituen (LA vs. HC eta LA vs. BN, p ≤ 0,001 egokitua, eragina > 0,01).Aldaketa hauek piruvatoaren metabolismoaren, triptofanoaren metabolismoaren, niazinaren eta nikotinamidaren metabolismoaren, glikolisiaren, TCA zikloaren eta purinen metabolismoaren asaldurak izan ziren (5a. irudia).Ondoren, metabolomika zuzendua egin genuen aldaketa handiak kuantifikazio absolutua erabiliz egiaztatzeko.Aldatutako bideetan ohiko metabolitoen zehaztapena kuadrupolo hirukoitzeko masa-espektrometriaren bidez (QQQ), metabolito estandar benetakoak erabiliz.Metabolomikaren azterketaren xede-laginaren ezaugarri demografikoak 4. Taula Osagarrian jasota daude. Gure metabolomika globalaren emaitzekin bat etorriz, analisi kuantitatiboak baieztatu zuen hipoxantina eta xantina, piruvatoa eta laktatoa handitu zirela LAn BN eta HC-rekin alderatuta (5b, c, irudia). p <0,05).Hala ere, metabolito horietan ez zen desberdintasun esanguratsurik aurkitu BN eta HCren artean.
KEGG bidearen aberastearen analisia LA taldean metabolito nabarmen desberdinen analisia BN eta HC taldeekin alderatuta.Bi isatseko Globaltest bat erabili zen, eta p balioak Holm-Bonferroni metodoa erabiliz doitu ziren (p ≤ 0.001 egokitua eta efektuaren tamaina > 0.01).b–d Biolinaren grafikoak hipoxantina, xantina, laktato, piruvato eta triptofano mailak erakusten dituzten HC, BN eta LA serumean LC-MS/MS bidez zehaztuta (n = 70 talde bakoitzeko).Lerro zuriek eta beltzek mediana eta kuartila adierazten dute, hurrenez hurren.e Biolin grafikoa SLC7A5 eta QPRT-ren mRNA-ren adierazpen normalizatua erakusten du biriketako adenokartzinometan (n = 513) biriketako ehun normalarekin (n = 59) LUAD-TCGA datu-multzoarekin alderatuta.Lauki zuriak kuartil arteko tartea adierazten du, erdiko lerro beltz horizontalak mediana adierazten du eta laukitik hedatzen den marra beltz bertikalak % 95eko konfiantza tartea (CI) adierazten du.f SLC7A5 eta GAPDH adierazpenaren Pearson korrelazio grafikoa biriketako adenokartzinometan (n = 513) eta biriketako ehun normaletan (n = 59) TCGA datu multzoan.Eremu grisak %95eko CI adierazten du.r, Pearson korrelazio-koefizientea.g LC-MS/MS bidez zehaztutako shRNA kontrola ez-espezifikoa (NC) eta shSLC7A5 (Sh1, Sh2) transfektatutako A549 zeluletan triptofano maila normalizatua.Talde bakoitzeko bost lagin biologikoki independenteen analisi estatistikoa aurkezten da.h NADt-ren maila zelularrak (NAD osoa, NAD+ eta NADH barne) A549 zeluletan (NC) eta SLC7A5 knockdown A549 zeluletan (Sh1, Sh2).Talde bakoitzeko hiru lagin biologikoki independenteen analisi estatistikoa aurkezten da.i A549 zelulen jarduera glikolitikoa SLC7A5 knockdown aurretik eta ondoren zelulaz kanpoko azidotze tasaren (ECAR) neurtu zen (n = 4 lagin biologikoki independente talde bakoitzeko).2-DG,2-desoxi-D-glukosa.Bi isatseko Student-en t proba erabili zen (b–h).(g–i), errore-barrak batez bestekoa ± SD adierazten dute, esperimentu bakoitza hiru aldiz egin zen modu independentean eta emaitzak antzekoak izan ziren.Iturburu-datuak iturburu-datuen fitxategien moduan ematen dira.
LA taldean triptofanoaren metabolismoaren aldaketaren eragin handia kontuan hartuta, HC, BN eta LA taldeetan triptofano-mailak ere ebaluatu ditugu QQQ erabiliz.Serum triptofanoa LAn HC edo BNrekin alderatuta murriztu zela aurkitu genuen (p < 0,001, 5d irudia), eta hori bat dator aurreko aurkikuntzekin, zirkulatzen duten triptofano-maila baxuagoak direla biriketako minbizia duten pazienteetan kontrol-taldeko kontrol osasuntsuetan baino33,34. ,35.PET/CT trazatzailea 11C-metil-L-triptofanoa erabiliz beste ikerketa batek aurkitu zuen biriketako minbiziaren ehunean triptofanoaren seinalearen atxikipen-denbora nabarmen handitu zela lesio onberekin edo ehun arruntekin alderatuta36.Hipotesi egiten dugu LA serumeko triptofanoaren murrizketak biriketako minbizi-zelulek triptofanoaren hartze aktiboa islatu dezaketela.
Jakina da triptofanoaren katabolismoaren kinureninaren bidearen azken produktua NAD+37,38 dela, hau da, glizeraldehido-3-fosfatoaren 1,3-bisfosfoglizeratoarekin glikolisian erreakziorako substratu garrantzitsua39.Aurreko ikerketek triptofanoaren katabolismoak erregulazio immunean duen paperean zentratu diren arren, oraingo ikerketan ikusitako triptofanoaren deserregulazioaren eta bide glikolitikoen arteko elkarrekintza argitu nahi izan dugu.Solutu garraiatzaileen familiako 7 kidea (SLC7A5) triptofano garraiatzaile bat dela ezagutzen da43,44,45.Azido kinolinikoa fosforibosiltransferasa (QPRT) kinureninaren bidetik behera dagoen entzima bat da, azido kinolinikoa NAMN46 bihurtzen duena.LUAD TCGA datu-multzoaren ikuskapenak agerian utzi zuen bai SLC7A5 eta bai QPRT tumore-ehunean nabarmen gora egin zutela ehun normalarekin alderatuta (5e. irudia).Igoera hori biriketako adenokartzinomaren I eta II eta III eta IV faseetan ikusi zen (11. irudi osagarria), tumorigenesiarekin lotutako triptofanoaren metabolismoaren asaldura goiztiarrak adieraziz.
Gainera, LUAD-TCGA datu-multzoak SLC7A5 eta GAPDH mRNA adierazpenaren arteko korrelazio positiboa erakutsi zuen minbizi-gaixoen laginetan (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5f irudia).Aitzitik, ez zen korrelazio esanguratsurik aurkitu biriketako ehun normaletan gene sinaduren artean (r = 0,25, p = 0,06, 5f irudia).A549 zeluletan SLC7A5 (12. irudi osagarria) kolpeak triptofano zelularra eta NAD(H) mailak nabarmen murriztu zituen (5g, h irudia), jarduera glikolitikoa arintzea eraginez, zelulaz kanpoko azido-tasa (ECAR) neurtuta (1. irudia).5i).Horrela, serumaren eta in vitro detekzioan izandako aldaketa metabolikoetan oinarrituta, triptofanoaren metabolismoak kinureninaren bidetik NAD+ sor dezakeela eta biriketako minbiziaren glukolisia sustatzeko paper garrantzitsua izan dezakeela planteatzen dugu.
Ikerketek frogatu dute LDCT bidez detektatutako biriketako nodulu zehaztugabeen kopuru handi batek PET-CT, biriketako biopsia eta gehiegizko tratamendua bezalako proba osagarrien beharra ekar dezakeela gaiztoaren diagnostiko faltsu-positibo baten ondorioz.31 6. Irudian ikusten den bezala, gure ikerketak serum metabolitoen panel bat identifikatu zuen, CT bidez detektaturiko biriketako noduluen arriskuen estratifikazioa hobetu dezakeen balio diagnostiko potentziala duena.
Biriketako noduluak dosi baxuko konputagailu bidezko tomografia (LDCT) erabiliz ebaluatzen dira, kausa onberak edo gaiztoak iradokitzen dituzten irudiekin.Noduluen emaitza ziurgabeak jarraipen-bisita sarri, alferrikako esku-hartzeak eta gehiegizko tratamendua ekar ditzake.Balio diagnostikoa duten serum sailkatzaile metabolikoak sartzeak arriskuen ebaluazioa eta biriketako noduluen ondorengo kudeaketa hobe dezake.PET positroien igorpen-tomografia.
AEBetako NLST ikerketaren eta Europako NELSON ikerketaren datuek iradokitzen dute arrisku handiko taldeen baheketak dosi baxuko konputagailu bidezko tomografiarekin (LDCT) biriketako minbiziaren heriotza murriztu dezakeela1,3.Hala ere, arriskuen ebaluazioa eta ondorengo kudeaketa klinikoa LDCT-k detektaturiko biriketako nodulu gorabeheratsuen kopuru handien kudeaketa klinikoa izaten jarraitzen du.Helburu nagusia lehendik dauden LDCTn oinarritutako protokoloen sailkapen zuzena optimizatzea da, biomarkatzaile fidagarriak sartuz.
Zenbait biomarkatzaile molekular, odol metabolitoak esaterako, biriketako minbizia kontrol osasuntsuekin alderatuz identifikatu dira15,17.Oraingo ikerketan, serum metabolomikaren analisiaren aplikazioan zentratu ginen LDCTk kasualitatez detektaturiko biriketako nodulu onberak eta gaiztoak bereizteko.Kontrol osasuntsuaren (HC), biriketako nodulu onberak (BN) eta I. faseko biriketako adenokartzinomaren (LA) laginak UPLC-HRMS analisiarekin alderatu ditugu.HC eta BN-k profil metaboliko antzekoak zituztela ikusi genuen, eta LAk, berriz, aldaketa esanguratsuak erakutsi zituen HC eta BNrekin alderatuta.LA HC eta BN-tik bereizten duten serum metabolitoen bi multzo identifikatu ditugu.
Nodulu onberak eta gaiztoak LDCTn oinarritutako egungo identifikazio-eskema, batez ere, denboran zehar noduluen tamainan, dentsitatean, morfologian eta hazkuntza-tasan oinarritzen da30.Aurretik egindako ikerketek erakutsi dute noduluen tamaina biriketako minbizia izateko probabilitatearekin estu lotuta dagoela.Arrisku handiko pazienteetan ere, gaiztotasuna izateko arriskua <6 mm-ko nodoetan <1% da.6 eta 20 mm bitarteko noduluen gaiztotasun arriskua %8tik %64ra bitartekoa da30.Hori dela eta, Fleischner Elkarteak 6 mm-ko mozketaren diametroa gomendatzen du ohiko CT jarraipenerako.29 Hala ere, 6 mm baino handiagoak diren biriketako nodulu zehaztugabeen (IPN) arriskuen ebaluazioa eta kudeaketa ez dira behar bezala egin 31 .Sortzetiko gaixotasun kardiobaskularren egungo kudeaketa arretaz itxarotean oinarritzen da normalean, maiz CT monitorizazioarekin.
Balidatutako metabolomaren arabera, lehenengo aldiz frogatu genuen sinadura metabolomikoen gainjartzea gizabanako osasuntsuen eta <6 mm-ko nodulu onberak.Antzekotasun biologikoa bat dator aurreko CT-ren aurkikuntzekin, noduluak <6 mm-ko gaiztotasun arriskua nodulurik gabeko subjektuentzat bezain baxua dela.30 Kontuan izan behar da gure emaitzek ere frogatzen dutela <6 mm eta ≥6 mm-ko nodulu onberak altua dutela. profil metabolomikoetan antzekotasuna, etiologia onberaren definizio funtzionala koherentea dela iradokitzen du noduluaren tamaina edozein dela ere.Beraz, diagnostiko-serum-metabolitoen panel modernoek saiakuntza bakarra eskain dezakete CTn hasieran noduluak detektatzen direnean eta serieko monitorizazioa murrizten dutenean.Aldi berean, biomarkatzaile metabolikoen panel berak ≥6 mm-ko tamainako nodulu gaiztoak bereizten zituen nodulu onberetatik eta CT irudietan antzeko tamaina eta ezaugarri morfologiko anbiguoak dituzten IPNetarako iragarpen zehatzak eman zituen.Serumaren metabolismoaren sailkatzaile honek ondo funtzionatu zuen ≥6 mm-ko noduluen gaiztotasuna iragartzeko 0,927ko AUCarekin.Batera hartuta, gure emaitzek adierazten dute serumaren sinadura metabolomiko bakarrek tumoreek eragindako aldaketa metaboliko goiztiarrak isla ditzaketela eta arrisku-iragarle gisa balio potentziala izan dezaketela, noduluaren tamainaren arabera.
Nabarmentzekoa, biriketako adenokartzinoma (LUAD) eta zelula eskamosoen kartzinoma (LUSC) dira zelula ez-txikietako biriketako minbiziaren (NSCLC) mota nagusiak.LUSC tabako kontsumoarekin oso lotuta dagoela47 eta LUAD CT baheketan detektatu diren biriketako nodulu gorabeheratsuen histologia ohikoena dela kontuan hartuta, gure sailkatzaile-eredua I. faseko adenokartzinoma laginetarako bereziki eraiki zen.Wang eta lankideek ere LUADen zentratu zuten eta bederatzi lipido sinadura identifikatu zituzten lipidomika erabiliz, hasierako biriketako minbizia pertsona osasuntsuetatik bereizteko17.Gaur egungo sailkapen-eredua I. faseko LUSC eta 74 nodulu onberaren 16 kasutan probatu genuen eta LUSC iragarpen-zehaztasun baxua ikusi genuen (AUC 0,776), LUAD eta LUSC sinadura metabolomiko propioak izan ditzaketela iradokiz.Izan ere, LUAD eta LUSC etiologian, jatorri biologikoan eta aberrazio genetikoetan desberdinak direla frogatu da49.Hori dela eta, beste histologia mota batzuk sartu behar dira baheketa programetan biriketako minbizia populazioan oinarrituta detektatzeko prestakuntza-ereduetan.
Hemen, biriketako adenokartzinomaren maiz aldatzen diren sei bideak identifikatu ditugu kontrol osasuntsuekin eta nodulu onberekin alderatuta.Xantina eta hipoxantina purinen bide metabolikoko metabolito arruntak dira.Gure emaitzekin bat etorriz, purinen metabolismoarekin lotutako bitartekoak nabarmen handitu ziren biriketako adenokartzinoma duten pazienteen serum edo ehunetan kontrol osasuntsuekin edo inbaditzaile aurreko fasean dauden pazienteekin alderatuta15,50.Serum-xantina eta hipoxantina maila altuek azkar ugaltzen diren minbizi-zelulek eskatzen duten anabolismoa isla dezakete.Glukosaren metabolismoaren erregulazioa minbiziaren metabolismoaren ezaugarri ezaguna da51.Hemen, piruvatoaren eta laktatoaren gorakada nabarmena ikusi genuen LA taldean HC eta BN taldearekin alderatuta, eta hori bat dator zelula txikiko biriketako minbizia ez diren pazienteen (NSCLC) pazienteen serum metabolomaren profiletan bide glikolitikoen anomalien aurreko txostenekin. kontrol osasuntsuak.emaitzak koherenteak dira52,53.
Garrantzitsuena, biriketako adenokartzinomaren serumean piruvatoaren eta triptofanoaren metabolismoaren arteko alderantzizko korrelazioa ikusi genuen.Serum triptofano mailak LA taldean murriztu ziren HC edo BN taldearekin alderatuta.Interesgarria da kohorte prospektibo bat erabiliz aurreko eskala handiko ikerketa batek triptofano zirkulatzailearen maila baxuak biriketako minbizia izateko arrisku handiagoarekin erlazionatuta zeudela 54 .Triptofanoa elikagaietatik lortzen dugun funtsezko aminoazido bat da.Biriketako adenokartzinomaren triptofano serumaren agortzeak metabolito honen agortze azkarra isla dezakeela ondorioztatu dugu.Jakina da kinureninaren bidearen bidez triptofanoaren katabolismoaren azken produktua de novo NAD+ sintesiaren iturria dela.NAD+ batik bat salbamendu-bidearen bidez ekoizten denez, NAD+-k triptofanoaren metabolismoan osasunean eta gaixotasunean duen garrantzia zehaztu gabe dago46.TCGA datu-basearen azterketak frogatu zuen 7A5 (SLC7A5) triptofano garraiatzaile solutu garraiatzailearen adierazpena nabarmen handitu zela biriketako adenokartzinometan kontrol arruntekin alderatuta eta positiboki erlazionatuta zegoela GAPDH entzima glukolitikoaren adierazpenarekin.Aurreko ikerketek, batez ere, triptofanoaren katabolismoak tumoreen aurkako erantzun immunea zapaltzeko duen paperean zentratu dira40,41,42.Hemen frogatzen dugu biriketako minbizi-zeluletan SLC7A5-ren kolpearen ondorioz triptofanoaren harrapaketa inhibitzeak NAD zelularren mailak gerora murrizten dituela eta jarduera glikolitikoaren arintzearekin batera.Laburbilduz, gure ikerketak biriketako adenokartzinomaren eraldaketa gaiztoarekin lotutako serum-metabolismoaren aldaketen oinarri biologikoa eskaintzen du.
EGFR mutazioak NSCLC duten pazienteetan gidari-mutazio ohikoenak dira.Gure ikerketan, EGFR mutazioa duten pazienteek (n = 41) EGFR basati-mota duten pazienteen antzeko profil metabolomiko orokorrak dituztela ikusi dugu (n = 31), nahiz eta EGFR mutante batzuen pazienteen serum-maila gutxitu egin garen azilkarnitina gaixoetan.Azilkarnitinen finkatutako funtzioa zitoplasmatik matrize mitokondrialera azil taldeak garraiatzea da, gantz-azidoen oxidazioa eraginez energia ekoizteko 55 .Gure aurkikuntzekin bat, azken ikerketa batek EGFR mutantearen eta EGFR basatiaren tumoreen arteko antzeko metabolomaren profilak ere identifikatu zituen, biriketako adenokartzinoma ehunen 102 laginen metaboloma globala aztertuz50.Interesgarria da azilkarnitina edukia EGFR mutante taldean ere aurkitu zen.Hori dela eta, azilkarnitina-mailen aldaketek EGFR-ek eragindako aldaketa metabolikoak islatzen dituzten eta azpian dauden bide molekularrek azterketa gehiago merezi dezakete.
Ondorioz, gure ikerketak biriketako noduluen diagnostiko diferentziala egiteko serum-sailkatzaile metaboliko bat ezartzen du eta arriskuen ebaluazioa optimizatu eta kudeaketa klinikoa erraztu dezakeen lan-fluxu bat proposatzen du CT eskaneatu bahean oinarrituta.
Azterketa hau Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbiziaren Ospitaleko Etika Batzordeak, Sun Yat-sen Unibertsitateko Lehen Afiliatu Ospitaleak eta Zhengzhou Unibertsitateko Minbiziaren Ospitaleko Etika Batzordeak onartu zuten.Aurkikuntza eta barne baliozkotze taldeetan, pertsona osasuntsuen 174 suero eta nodulu onberetako 244 suero bildu ziren minbiziaren Kontrolerako eta Prebentziorako Sailean, Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbiziaren Zentroan eta 166 nodulu onberak urtero azterketa medikuak egiten ari ziren pertsonengandik.seruma.I. faseko biriketako adenokartzinomak Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbiziaren Zentroan bildu ziren.Kanpoko baliozkotze kohortean, 48 nodulu onberak izan ziren, 39 I etapako biriketako adenokarcinoma kasuak Sun Yat-sen Unibertsitateko Lehen Afiliatu Ospitalekoak eta 24 I. etapako biriketako adenokartzinoma Zhengzhouko Minbiziaren Ospitalekoak.Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbiziaren Zentroak I. faseko biriketako minbiziaren 16 kasu bildu zituen, ezarritako sailkatzaile metabolikoaren diagnostiko-gaitasuna probatzeko (pazienteen ezaugarriak 5. taula osagarrian agertzen dira).Aurkikuntza-kohortearen eta barne-balioztapen-kohortearen laginak 2018ko urtarrila eta 2020ko maiatza bitartean bildu ziren. Kanpoko baliozkotze-kohortearen laginak 2021eko abuztua eta 2022ko urria bitartean bildu ziren. Genero-alborapena gutxitzeko, gizonezkoen eta emakumezkoen kasu kopuru gutxi gorabehera berdin esleitu ziren bakoitzari. kohortea.Aurkikuntza Taldea eta Barne Berrikuspen Taldea.Parte-hartzaileen generoa auto-txostenaren arabera zehaztu zen.Parte-hartzaile guztien adostasun informatua lortu zen eta ez zen kalte-ordainik eman.Nodulu onberak zituzten subjektuak analisiaren unean 2 eta 5 urte bitarteko CT eskanearen puntuazio egonkorra zutenak izan ziren, kanpoko baliozkotze laginaren kasu bat izan ezik, ebakuntza aurretik bildutakoa eta histopatologiaren bidez diagnostikatu zena.Bronkitis kronikoa izan ezik.Biriketako adenokartzinoma kasuak biriketako erresekzioa baino lehen bildu ziren eta diagnostiko patologikoaren bidez baieztatu ziren.Baraualdiko odol laginak serum bereizteko hodietan bildu ziren, antikoagulatzailerik gabe.Odol laginak ordubetez koagulatu ziren giro-tenperaturan eta gero zentrifugatu ziren 2851 × g-tan 10 minutuz 4 ° C-tan, serum gainditzailea biltzeko.Serum alikuotak -80 °C-tan izoztu ziren metabolitoa atera arte.Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbiziaren Zentroko Minbiziaren Prebentziorako eta Azterketa Medikoko Sailak 100 emaile osasuntsuren serum multzo bat bildu zuen, 40 eta 55 urte bitarteko gizon eta emakume kopuru berdina barne.Lagin emaile bakoitzaren bolumen berdinak nahastu ziren, ondorioz igerilekua alikuota egin eta -80 °C-tan gorde zen.Serum-nahasketa erreferentziazko material gisa erabili zen kalitate-kontrolerako eta datuen estandarizaziorako.
Erreferentzia-seruma eta proba-laginak desizoztu ziren eta metabolitoak erauzketa-metodo konbinatuaren bidez (MTBE/metanol/ura) 56 erauzi ziren.Laburbilduz, 50 μl serum 225 μl metanol izotzez eta 750 μl izotz metil tert-butil eter (MTBE) nahastu ziren.Nahastu nahasketa eta izotz gainean inkubatu ordubetez.Ondoren, laginak nahastu eta zurrunbiloarekin nahastu ziren barne-estandarrak (13C-laktatoa, 13C3-piruvatoa, 13C-metionina eta 13C6-isoleucinea, Cambridge Isotope Laboratories-en erositako MS mailako ur-188 μlrekin).Ondoren, nahasketa zentrifugatu zen 15.000 × g-tan 10 minutuz 4 °C-tan, eta beheko fasea bi hoditara transferitu zen (125 μL bakoitza) LC-MS modu positiboan eta negatiboan aztertzeko.Azkenik, lagina lehortasunera lurrundu zen abiadura handiko huts-kontzentragailu batean.
Metabolito lehorrak %80ko azetonitriloko 120 μl-tan eratu ziren, 5 minutuz zurrunbiloan jarri eta 15.000 × g-tan zentrifugatu ziren 10 minutuz 4 °C-tan.Gainak metabolomika azterketetarako mikrotxertaketadun beirazko ontzietara transferitu ziren.Metabolomika bidegabeko analisia ultra-errendimendu likidoaren kromatografia-bereizmen handiko masa-espektrometria (UPLC-HRMS) plataforma batean.Metabolitoak Dionex Ultimate 3000 UPLC sistema eta ACQUITY BEH Amide zutabe bat erabiliz bereizi ziren (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Ioi positibo moduan, fase mugikorrak % 95 (A) eta % 50 azetonitriloa (B) ziren, bakoitzak 10 mmol/L amonio azetatoa eta % 0,1 azido formikoa zituen.Modu negatiboan, A eta B fase mugikorrek % 95 eta % 50 azetonitrilo zuten, hurrenez hurren, bi faseek 10 mmol/L amonio azetatoa zuten, pH = 9. Gradiente-programa hau izan zen: 0-0,5 min, % 2 B;0,5-12 min, % 2-50 B;12-14 min, % 50-98 B;14-16 min, % 98 B;16–16.1.min, % 98 –2 B;16,1-20 min, % 2 B. Zutabea 40 °C-tan mantendu da eta lagina 10 °C-tan laginketa automatikoan.Emaria 0,3 ml/min zen, injekzio bolumena 3 μl.Q-Exactive Orbitrap masa-espektrometroa (Thermo Fisher Scientific) elektrospray ionizazio-iturri batekin (ESI) iturburua eskaneatzeko moduan funtzionatu zen eta ddMS2 monitorizazio moduarekin batera datu bolumen handiak biltzeko.MS parametroak honela ezarri ziren: spray-tentsioa +3,8 kV/- 3,2 kV, tenperatura kapilarra 320 °C, babes-gasa 40 arb, gas osagarria 10 arb, zunda-berogailuaren tenperatura 350 °C, eskaneatzeko tartea 70-1050 m/h, ebazpena.70 000. Datuak Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) erabiliz eskuratu dira.
Datuen kalitatea ebaluatzeko, kalitate kontrol bateratua (QC) laginak sortu ziren lagin bakoitzeko 10 μL alikuota gainditzailetik kenduz.Sekuentzia analitikoaren hasieran kalitate-kontroleko sei lagin injekzio aztertu ziren UPLC-MS sistemaren egonkortasuna ebaluatzeko.Kalitate-kontroleko laginak aldian-aldian sartzen dira lotean.Ikerketa honetako 11 serum-lagin lote guztiak LC-MS bidez aztertu ziren.100 emaile osasuntsuren serum-igerileku-nahasketa baten alikuotak erabili ziren erreferentziazko material gisa dagozkien loteetan erauzketa-prozesua kontrolatzeko eta lote batetik bestera efektuetarako doitzeko.Aurkikuntza-kohortearen, barne baliozkotze-kohortearen eta kanpoko baliozkotze-kohortearen metabolomikaren analisia egin zen Sun Yat-sen Unibertsitateko Metabolomika Zentroan.Guangdong Unibertsitateko Teknologia Azterketa eta Proba Zentroko kanpoko laborategiak kanpoko kohorteko 40 lagin ere aztertu zituen sailkatzaile-ereduaren errendimendua probatzeko.
Erauzi eta berreraiki ondoren, serum-metabolitoen kuantifikazio absolutua neurtu zen errendimendu ultra-altuko kromatografia likido-tandem masa-espektrometria erabiliz (Agilent 6495 hirukoitza koadripoloa) elektrospray ionizazio iturri batekin (ESI) erreakzio anitzeko monitorizazio moduan (MRM) moduan.Metabolitoak bereizteko ACQUITY BEH Amide zutabe bat (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) erabili da.Fase mugikorra % 90 (A) eta % 5 azetonitrilo (B) izan zen, 10 mmol/L amonio azetatoarekin eta % 0,1 amoniako disoluzioarekin.Gradiente-programa hau izan zen: 0-1,5 min, % 0 B;1,5-6,5 min, % 0-15 B;6,5-8 min, % 15 B;8–8,5 min, %15–%0 B;8,5-11,5 min, %0 B.Zutabea 40 °C-tan mantendu zen eta lagina 10 °C-tan laginketa automatikoan.Emaria 0,3 ml/min izan zen eta injekzio bolumena 1 μL.MS parametroak honela ezarri ziren: tentsio kapilarra ± 3,5 kV, nebulizatzailearen presioa 35 psi, zorroaren gas-fluxua 12 L/min, zorroaren gasaren tenperatura 350 °C, lehortzeko gasaren tenperatura 250 °C eta lehortzeko gasaren emaria 14 l/min.Triptofano, piruvato, laktato, hipoxantina eta xantinaren MRM bihurketak 205,0-187,9, 87,0-43,4, 89,0-43,3, 135,0-92,3 eta 151,0-107 izan ziren.9 hurrenez hurren.Datuak Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) erabiliz bildu dira.Serum-laginetarako, triptofanoa, piruvatoa, laktatoa, hipoxantina eta xantina kuantifikatu ziren nahaste-disoluzio estandarren kalibrazio-kurbak erabiliz.Zelula laginetarako, triptofanoaren edukia barne estandarrera eta zelulen proteina masara normalizatu zen.
Pico-erauzketa (m/z eta atxikipen-denbora (RT)) Compound Discovery 3.1 eta TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) erabiliz egin zen.Loteen arteko potentzial-diferentziak ezabatzeko, proba-laginaren gailur bereizgarri bakoitza lote bereko erreferentzia-materialaren gailur bereizgarriarekin zatitu zen ugaritasun erlatiboa lortzeko.Estandarizazioaren aurretik eta ondoren barne estandarren desbideratze estandar erlatiboak 6. Taula osagarrian agertzen dira. Bi taldeen arteko desberdintasunak aurkikuntza-tasa faltsuak (FDR<0,05, Wilcoxon-en sinadura-proba) eta tolestura-aldaketa (> 1,2 edo <0,83) ezaugarritu dira.Erauzitako ezaugarrien MS datu gordinak eta serum bidez zuzendutako MS datu gordinak 1. datu osagarrietan eta 2. datu osagarrietan agertzen dira, hurrenez hurren.Peak anotazioa definitutako lau identifikazio-mailetan oinarrituta egin zen, identifikatutako metabolitoak, ustezko ohartariko konposatuak, ustezko konposatu-klaseak eta konposatu ezezagunak 22 barne.Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) datu-baseen bilaketetan oinarrituta, MS/MS bat datozen estandarrak balioztatutako edo bat-etortze zehatzeko oharrak mzCloud (puntuazioa > 85) edo Chemspider-en konposatu biologikoak aukeratu ziren azkenean metabolomaren diferentzialaren artean.Ezaugarri bakoitzeko gailurreko oharpenak 3. datu osagarrietan sartzen dira. MetaboAnalyst 5.0 batura normalizatutako metabolito ugaritasunaren analisi unibateko erabili zen.MetaboAnalyst 5.0-k KEGG bidearen aberaste-analisia ere ebaluatu zuen, metabolito nabarmen desberdinetan oinarrituta.Osagai nagusien analisia (PCA) eta karratu txikienen analisi partziala (PLS-DA) ropls software paketea erabiliz (v.1.26.4) pilaren normalizazioarekin eta eskalatze automatikoan aztertu ziren.Nodulu gaiztoa iragartzeko metabolito-biomarkatzaile-eredu optimoa erregresio logistiko bitarra erabiliz sortu zen, gutxieneko uzkurtze eta hautaketa-operadore absolutuarekin (LASSO, R paketea v.4.1-3).Eredu diskriminatzailearen errendimendua detekzio- eta baliozkotze-multzoetan, ROC analisian oinarritutako AUC estimatuz ezaugarritu zen pROC paketearen arabera (v.1.18.0.).Probabilitate-mozketa optimoa ereduaren Youden indize maximoan oinarrituta lortu da (sentsibilitatea + espezifikotasuna - 1).Atalasea baino balio txikiagoak edo handiagoak dituzten laginak nodulu onberak eta biriketako adenokartzinoma gisa aurreikusiko dira, hurrenez hurren.
A549 zelulak (#CCL-185, American Type Culture Collection) %10 FBS zuen F-12K medioan hazi ziren.SLC7A5 helburu duten ARN (shRNA) sekuentzia laburrak eta helburu gabeko kontrol bat (NC) txertatu ziren pLKO.1-puro bektore lentibiralean.ShSLC7A5-ren zentzuaren aurkako sekuentziak hauek dira: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).SLC7A5 (#5347) eta tubulinaren (#2148) aurkako antigorputzak Cell Signaling Technology-tik erosi ziren.SLC7A5 eta tubulinaren aurkako antigorputzak 1:1000ko diluzioan erabili ziren Western blot analisirako.
Seahorse XF Glycolytic Stress Test-ek zelulaz kanpoko azidotze maila (ECAR) neurtzen du.Saiakeran, glukosa, oligomizina A eta 2-DG sekuentzialki administratu ziren ECAR-ek neurtutako ahalmen glikolitiko zelularra probatzeko.
Xederik gabeko kontrolarekin (NC) eta shSLC7A5 (Sh1, Sh2) transfektatutako A549 zelulak 10 cm-ko diametroko plateretan xaflatu ziren.Zelula-metabolitoak % 80ko metanol urtsu izotzezko 1 mlrekin atera ziren.Metanol-soluzioko zelulak kendu, hodi berri batean bildu eta 15.000 × g-tan zentrifugatu ziren 15 minutuz 4 °C-tan.Bildu 800 µl gainditzaile eta lehortu abiadura handiko huts-kontzentragailu batekin.Ondoren, lehortutako metabolito-pilletak triptofano-mailak aztertu ziren LC-MS/MS erabiliz goian deskribatu bezala.A549 zeluletan (NC eta shSLC7A5) NAD(H) zelularren mailak NAD+/NADH kit kolorimetriko kuantitatibo batekin (#K337, BioVision) neurtu ziren fabrikatzailearen argibideen arabera.Lagin bakoitzeko proteina mailak neurtu ziren metabolitoen kopurua normalizatzeko.
Ez da metodo estatistikorik erabili laginaren tamaina aldez aurretik zehazteko.Biomarkatzaileen aurkikuntzara zuzendutako aurreko metabolomika-ikasketak15,18 erreferentziatzat hartu dira tamaina zehazteko, eta txosten horiekin alderatuta, gure lagina egokia izan da.Ez da laginik baztertu azterketa-kohortetik.Serum-laginak ausaz esleitu ziren aurkikuntza-talde batera (306 kasu, % 74,6) eta barne baliozkotze-talde batera (104 kasu, % 25,4) helburu gabeko metabolomika ikasketetarako.Talde bakoitzeko 70 kasu ausaz ere hautatu ditugu metabolomika-azterketetarako aurkikuntza multzotik.Ikertzaileak taldeen esleipenari itsutu egin ziren LC-MS datuen bilketa eta analisian zehar.Metabolomikaren datuen eta zelulen esperimentuen analisi estatistikoak dagozkien Emaitzak, Irudien Kondairak eta Metodoak ataletan deskribatzen dira.Triptofano, NADT eta jarduera glikolitikoaren kuantifikazioa hiru aldiz independenteki egin zen emaitza berdinekin.
Azterketaren diseinuari buruzko informazio gehiago lortzeko, ikusi artikulu honekin lotutako Natural Portfolio txostenaren laburpena.
Erauzitako ezaugarrien MS datu gordinak eta erreferentziako serumaren MS datu normalizatuak 1. datu osagarrietan eta 2. datu osagarrietan agertzen dira, hurrenez hurren.Ezaugarri diferentzialen goreneko oharpenak 3. datu osagarrietan aurkezten dira. LUAD TCGA datu-multzoa https://portal.gdc.cancer.gov/-tik deskargatu daiteke.Grafikoa marrazteko sarrerako datuak iturriko datuetan ematen dira.Iturburu datuak artikulu honetarako ematen dira.
Biriketako Baheketa Azterketa Talde Nazionala, etab. Biriketako minbiziaren heriotza-tasa murriztea dosi baxuko tomografia informatikoarekin.Ipar Ingalaterra.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR eta Prophet, PC Biriketako minbiziaren baheketa dosi baxuko CT helikoidala erabiliz: National Lung Screening Study (NLST) emaitzak.J. Med.18. pantaila, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Biriketako minbiziaren hilkortasuna murriztea CT bolumetriko baheketarekin ausazko proba batean.Ipar Ingalaterra.J. Med.382, 503–513 (2020).
Argitalpenaren ordua: 2023-09-18