Tomografia konputatuaren (TC) bidez identifikatutako biriketako noduluen diagnostiko diferentziala erronka bat da oraindik praktika klinikoan. Hemen, 480 serum laginen metaboloma globala karakterizatzen dugu, kontrol osasuntsuak, biriketako nodulu onberak eta I. estadioko biriketako adenokartzinoma barne. Adenokartzinomek metaboloma-profil bereziak erakusten dituzte, nodulu onberek eta pertsona osasuntsuek, berriz, antzekotasun handia dute metaboloma-profiletan. Aurkikuntza-taldean (n = 306), 27 metabolitoko multzo bat identifikatu zen nodulu onberak eta gaiztoak bereizteko. Bereizle-ereduaren AUC barne-balidazio (n = 104) eta kanpoko balioztatze (n = 111) taldeetan 0,915 eta 0,945 izan zen, hurrenez hurren. Bideen analisiak biriketako adenokartzinoma serumean triptofanoaren gutxitzearekin lotutako metabolito glukolitikoen igoera agerian utzi zuen, nodulu onberekin eta kontrol osasuntsuekin alderatuta, eta iradoki zuen triptofanoaren xurgapenak glikolisia sustatzen duela biriketako minbizi-zeluletan. Gure ikerketak serumeko metabolitoen biomarkatzaileen balioa azpimarratzen du TC bidez detektatutako biriketako noduluen arriskua ebaluatzeko.
Diagnostiko goiztiarra ezinbestekoa da minbizia duten pazienteen biziraupen-tasak hobetzeko. AEBetako Biriketako Minbiziaren Bahetze Saiakuntza Nazionalaren (NLST) eta Europako NELSON Ikerketaren emaitzek erakutsi dute dosi baxuko tomografia konputatu bidezko baheketak (LDCT) nabarmen murriztu dezakeela biriketako minbiziaren hilkortasuna arrisku handiko taldeetan1,2,3. LDCT biriketako minbiziaren baheketan asko erabiltzen denetik, biriketako nodulu asintomatikoen erradiografia-aurkikuntza ustekabeen intzidentzia handitzen jarraitu du 4. Biriketako noduluak 3 cm-ko diametroko foku-opakutasun gisa definitzen dira 5. Zailtasunak ditugu gaiztakeriaren probabilitatea ebaluatzeko eta LDCTn ustekabean detektatzen diren biriketako nodulu kopuru handiari aurre egiteko. TCren mugek jarraipen-azterketa maiz eta emaitza faltsu-positiboak ekar ditzakete, eta horrek esku-hartze beharrezkoak eta gehiegizko tratamendua dakartza6. Hori dela eta, biomarkatzaile fidagarriak eta erabilgarriak garatu behar dira biriketako minbizia hasierako faseetan behar bezala identifikatzeko eta nodulu onberenak hasierako detekzioan bereizteko 7.
Odolaren (seruma, plasma, odol periferikoko zelula mononuklearrak) analisi molekular integralak, genomika, proteomika edo DNAren metilazioa barne8,9,10, gero eta interes handiagoa piztu du biriketako minbiziaren biomarkatzaile diagnostikoak aurkitzeko. Bitartean, metabolomikaren ikuspegiek ekintza endogeno eta exogenoek eragindako zelulen azken produktuak neurtzen dituzte eta, beraz, gaixotasunaren agerpena eta emaitza aurreikusteko erabiltzen dira. Kromatografia likidoa-tandem masa-espektrometria (LC-MS) metabolomika azterketetarako oso erabilia den metodoa da, bere sentikortasun handia eta tarte dinamiko zabala duelako, propietate fisiko-kimiko desberdinak dituzten metabolitoak har ditzakeelako11,12,13. Plasmaren/serumaren analisi metabolomiko globala erabili den arren biriketako minbiziaren diagnostikoarekin14,15,16,17 eta tratamenduaren eraginkortasunarekin lotutako biomarkatzaileak identifikatzeko,18 biriketako nodulu onberak eta gaiztoak bereizteko serumeko metabolitoen sailkatzaileak oraindik asko aztertu gabe daude. -ikerketa masiboa.
Adenokartzinoma eta zelula ez-txikiko kartzinoma dira biriketako minbizi ez-zelula txikien (NSCLC) bi azpimota nagusiak. Hainbat TC bahetze-probak adierazten dute adenokartzinoma dela biriketako minbizi mota histologiko ohikoena1,19,20,21. Ikerketa honetan, ultra-errendimenduko kromatografia likidoa-bereizmen handiko masa-espektrometria (UPLC-HRMS) erabili dugu metabolomika-analisiak egiteko guztira 695 serum-laginetan, kontrol osasuntsuak, biriketako nodulu onberak eta TC bidez detektatutako ≤3 cm-koak barne. I. estadioko biriketako adenokartzinomaren baheketa. Serumeko metabolitoen panel bat identifikatu dugu, biriketako adenokartzinoma nodulu onberetatik eta kontrol osasuntsuetatik bereizten duena. Bideen aberaste-analisiak agerian utzi du triptofanoaren eta glukosaren metabolismo anormala alterazio ohikoak direla biriketako adenokartzinoman, nodulu onberekin eta kontrol osasuntsuekin alderatuta. Azkenik, LDCT bidez detektatutako biriketako nodulu gaiztoak eta onberak bereizteko espezifikotasun eta sentikortasun handiko serum metaboliko sailkatzaile bat ezarri eta balioztatu dugu, eta horrek diagnostiko diferentzial goiztiarra eta arriskuen ebaluazioan lagun dezake.
Oraingo ikerketan, sexuaren eta adinaren arabera parekatutako serum laginak atzera begira bildu ziren 174 kontrol osasuntsu, biriketako nodulu onberak zituzten 292 paziente eta I. estadioko biriketako adenokartzinoma zuten 229 paziente. 695 subjektuen ezaugarri demografikoak 1. taula osagarrian ageri dira.
1a irudian erakusten den bezala, guztira 480 serum lagin bildu ziren Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbizi Zentroan, horien artean 174 kontrol osasuntsu (HC), 170 nodulu onber (BN) eta 136 I. estadioko biriketako adenokartzinoma (LA) lagin. Metabolomikako profilazio zuzendu gabearen aurkikuntza kohortea kromatografia likido ultra-errendimenduarekin eta bereizmen handiko masa-espektrometriarekin (UPLC-HRMS) erabiliz. 1. irudi osagarrian erakusten den bezala, LA eta HC, LA eta BN arteko metabolito desberdinak identifikatu ziren sailkapen eredu bat ezartzeko eta bide desberdinen analisi gehiago aztertzeko. Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbizi Zentroak bildutako 104 lagin eta beste bi ospitalek bildutako 111 lagin barne eta kanpo baliozkotzea jasan zuten, hurrenez hurren.
a Ikerketa-populazioa aurkikuntza-kohortean, serumaren metabolomikaren analisi globala egin zitzaiona ultra-errendimenduko likido-kromatografia-bereizmen handiko masa-espektrometria (UPLC-HRMS) erabiliz. b Ikerketa-kohorteko 480 serum-laginen metaboloma osoaren gutxieneko karratuen diskriminatzaile-analisi partziala (PLS-DA), kontrol osasuntsuak (HC, n = 174), nodulu onberak (BN, n = 170) eta I. estadioko biriketako adenokartzinoma (Los Angeles, n = 136) barne. +ESI, elektrospray ionizazio modu positiboa, -ESI, elektrospray ionizazio modu negatiboa. c–e Bi taldetan ugaritasun nabarmen desberdinak dituzten metabolitoak (bi isatseko Wilcoxon zeinu-mailako testa, aurkikuntza faltsuaren tasa doitutako p balioa, FDR <0,05) gorriz (tolestura-aldaketa > 1,2) eta urdinez (tolestura-aldaketa < 0,83) ageri dira. ) sumendiaren grafikoan ageri dira. f Multzokatze hierarkikoko bero-mapa, LA eta BN arteko metabolito anotatuen kopuruan desberdintasun esanguratsuak erakusten dituena. Jatorrizko datuak iturburu-datuen fitxategien moduan ematen dira.
Aurkikuntza-taldeko 174 HC, 170 BN eta 136 LA-ren serumeko metaboloma osoa UPLC-HRMS analisi bidez aztertu zen. Lehenik eta behin, kalitate-kontroleko (QC) laginak gainbegiratu gabeko osagai nagusien analisi (PCA) eredu baten erdian biltzen direla erakusten dugu, egungo ikerketaren errendimenduaren egonkortasuna berretsiz (2. irudi osagarria).
1b irudiko gutxieneko karratuen diskriminatzaile partzialeko analisian (PLS-DA) erakusten den bezala, ikusi genuen LA eta BN, LA eta HC artean desberdintasun argiak zeudela elektroihinztadura ionizazio modu positiboetan (+ESI) eta negatiboetan (−ESI). Hala ere, ez zen desberdintasun esanguratsurik aurkitu BN eta HC artean +ESI eta -ESI baldintzetan.
382 ezaugarri bereizgarri aurkitu genituen LA eta HC artean, 231 ezaugarri bereizgarri LA eta BN artean, eta 95 ezaugarri bereizgarri BN eta HC artean (Wilcoxon zeinu-mailaren testa, FDR <0,05 eta aldaketa anizkoitza >1,2 edo <0,83) (.1c-e irudia). . Gailurrak gehiago anotatu ziren (3. datu osagarria) datu-base baten aurka (mzCloud/HMDB/Chemspider liburutegia) m/z balioaren, atxikipen-denboraren eta zatikatze-masa-espektroaren bilaketaren bidez (xehetasunak Metodoen atalean deskribatuta) 22. Azkenik, ugaritasunean alde esanguratsuak zituzten 33 eta 38 metabolito anotatu identifikatu ziren LA versus BN (1f irudia eta 2. taula osagarria) eta LA versus HC (3. irudi osagarria eta 2. taula osagarria), hurrenez hurren. Aldiz, ugaritasunean alde esanguratsuak zituzten 3 metabolito baino ez ziren identifikatu BN eta HC-n (2. taula osagarria), PLS-DA-n BN eta HC arteko gainjartzearekin bat etorriz. Metabolito diferentzial hauek biokimika sorta zabala hartzen dute barne (4. irudi osagarria). Emaitza hauek guztiek serumeko metaboloman aldaketa esanguratsuak erakusten dituzte, biriketako minbiziaren hasierako faseko eraldaketa gaiztoa islatzen dutenak, biriketako nodulu onberekin edo subjektu osasuntsuekin alderatuta. Bien bitartean, BN eta HCren serumeko metabolomaren antzekotasunak iradokitzen du biriketako nodulu onberek ezaugarri biologiko asko parteka ditzaketela pertsona osasuntsuekin. Hazkunde epidermikoaren faktorearen hartzailearen (EGFR) genearen mutazioak ohikoak direla kontuan hartuta 23. azpimotako biriketako adenokartzinomaren kasuan, gidarien mutazioek serumeko metaboloman duten eragina zehazten saiatu ginen. Ondoren, biriketako adenokartzinomaren taldeko EGFR egoera zuten 72 kasuren metaboloma-profil orokorra aztertu genuen. Interesgarria da, PCA analisian EGFR mutantea zuten pazienteen (n = 41) eta EGFR mota basatia zuten pazienteen (n = 31) arteko profil konparagarriak aurkitu genituen (5a irudi osagarria). Hala ere, 7 metabolito identifikatu genituen, eta haien ugaritasuna nabarmen aldatu zen EGFR mutazioa zuten pazienteetan, EGFR mota basatia zuten pazienteekin alderatuta (t testa, p < 0,05 eta aldaketa > 1,2 edo < 0,83) (5b irudi osagarria). Metabolito horien gehienak (7tik 5) azilkarnitinak dira, eta zeregin garrantzitsua dute gantz-azidoen oxidazio-bideetan.
2a irudian erakusten den lan-fluxuan ilustratzen den bezala, noduluen sailkapenerako biomarkatzaileak gutxieneko uzkurdura absolutua duten operadoreak erabiliz eta LA-n (n = 136) eta BN-n (n = 170) identifikatutako 33 metabolito diferentzialen araberako hautaketa erabiliz lortu ziren. Aldagaien konbinazio onena (LASSO) - erregresio logistiko bitarraren eredua. Hamar aldizko gurutzadura balidazioa erabili zen ereduaren fidagarritasuna probatzeko. Aldagaien hautaketa eta parametroen erregularizazioa λ24 parametroarekin duen probabilitate maximizazio zigorraren bidez doitzen dira. Metabolomika globalaren analisia modu independentean egin zen barne balidazio (n = 104) eta kanpoko balidazio (n = 111) taldeetan, diskriminatzaile ereduaren sailkapen errendimendua probatzeko. Ondorioz, aurkikuntza multzoko 27 metabolito identifikatu ziren AUC balio batez besteko handiena zuten diskriminatzaile eredu onenak bezala (2b irudia), eta horien artean 9k jarduera handitu zuten eta 18k jarduera gutxitu LA-n BN-rekin alderatuta (2c irudia).
Biriketako nodulu sailkatzaile bat eraikitzeko lan-fluxua, aurkikuntza-multzoan serumeko metabolitoen panel onena hautatzea barne, hamar aldizko gurutzaketa-balidazioaren bidezko erregresio logistiko bitar bat erabiliz eta barneko eta kanpoko balidazio-multzoetan iragarpen-errendimendua ebaluatuz. b LASSO erregresio-ereduaren gurutzaketa-balidazio-estatistikak biomarkatzaile metabolikoak hautatzeko. Goian emandako zenbakiek λ jakin batean hautatutako biomarkatzaileen batez besteko kopurua adierazten dute. Lerro puntuatu gorriak batez besteko AUC balioa adierazten du dagokion lambdan. Errore-barra grisek AUC balio minimoak eta maximoak adierazten dituzte. Lerro puntuatuak hautatutako 27 biomarkatzaileekin eredurik onena adierazten du. AUC, hartzailearen funtzionamendu-ezaugarriaren (ROC) kurbaren azpiko azalera. c LA taldeko hautatutako 27 metabolitoen tolestura-aldaketak aurkikuntza-taldeko BN taldearekin alderatuta. Zutabe gorria - aktibazioa. Zutabe urdina beherakada bat da. d–f Hartzailearen funtzionamendu-ezaugarriaren (ROC) kurbak, diskriminatzaile-ereduaren potentzia erakusten dutenak, aurkikuntza-, barneko eta kanpoko balidazio-multzoetako 27 metabolito-konbinaziotan oinarrituta. Iturburu-datuak iturburu-datu-fitxategien moduan ematen dira.
27 metabolito hauen erregresio-koefiziente haztatuetan oinarritutako iragarpen-eredu bat sortu zen (3. taula osagarria). 27 metabolito hauetan oinarritutako ROC analisiak 0,933ko kurba azpiko azalera (AUC) balioa eman zuen, aurkikuntza-taldearen sentikortasuna 0,868koa eta espezifikotasuna 0,859koa (2d irudia). Bitartean, LA eta HC arteko 38 metabolito diferentzial anotatuen artean, 16 metabolitok osatutako multzo batek 0,902ko AUC lortu zuen, 0,801eko sentikortasunarekin eta 0,856ko espezifikotasunarekin LA eta HC bereiztean (6a-c irudi osagarria). Metabolito diferentzialen tolestura-aldaketa atalase desberdinetan oinarritutako AUC balioak ere alderatu ziren. Ikusi genuen sailkapen-ereduak ondoen funtzionatu zuela LA eta BN (HC) bereizteko tolestura-aldaketa maila 1,2an ezarri zenean, 1,5 edo 2,0aren aldean (7a eta b irudi osagarriak). 27 metabolito taldetan oinarritutako sailkapen eredua barne eta kanpoko kohorteetan balioztatu zen. AUC 0,915 izan zen (sentsibilitatea 0,867, espezifikotasuna 0,811) barne balioztatzeko eta 0,945 (sentsibilitatea 0,810, espezifikotasuna 0,979) kanpoko balioztatzeko (2e eta f irudiak). Laborategi arteko eraginkortasuna ebaluatzeko, kanpoko kohorteko 40 lagin aztertu ziren kanpoko laborategi batean, Metodoen atalean deskribatzen den bezala. Sailkapenaren zehaztasunak 0,925eko AUC lortu zuen (8. irudi osagarria). Biriketako zelula ezkatatsuen kartzinoma (LUSC) biriketako minbizi ez-zelula txikien (NSCLC) bigarren azpimota ohikoena denez, biriketako adenokarzinomaren (LUAD) ondoren, profil metabolikoen erabilgarritasun potentzial balioztatua ere probatu genuen. BN eta LUSCren 16 kasu. LUSC eta BN arteko bereizketaren AUC 0,776 izan zen (9. irudi osagarria), eta horrek gaitasun eskasagoa adierazten du LUAD eta BN arteko bereizketarekin alderatuta.
Ikerketek erakutsi dute TC irudietan agertzen diren noduluen tamaina gaiztotasun probabilitatearekin korrelazionatuta dagoela eta noduluen tratamenduaren determinatzaile nagusia izaten jarraitzen duela25,26,27. NELSON bahetze-azterketaren kohorte handiaren datuen analisiak erakutsi zuen 5 mm-tik beherako noduluak dituzten subjektuetan gaiztotasun arriskua nodulurik gabeko subjektuetan antzekoa zela 28. Beraz, TC bidezko monitorizazio erregularra behar duen gutxieneko tamaina 5 mm-koa da, British Thoracic Society-k (BTS) gomendatzen duen bezala, eta 6 mm-koa, Fleischner Society-k gomendatzen duen bezala 29. Hala ere, 6 mm-tik gorako eta ezaugarri onbera nabarmenik gabeko noduluak, biriketako nodulu zehaztugabeak (IPN) deiturikoak, erronka handia izaten jarraitzen dute praktika klinikoan ebaluazioan eta kudeaketan30,31. Ondoren, noduluen tamainak metabolomika sinaduretan eragina zuen aztertu genuen, aurkikuntza eta barne balioztatze kohorteetako lagin multzoak erabiliz. 27 biomarkatzaile balioztatutan zentratuz, lehenik HC eta BN 6 mm-tik beherako metabolomaren PCA profilak alderatu genituen. HC eta BN-ren datu-puntu gehienak gainjarri zirela ikusi genuen, eta horrek erakusten du serumeko metabolitoen mailak antzekoak zirela bi taldeetan (3a irudia). Tamaina-tarte desberdinetako ezaugarri-mapak kontserbatu egin ziren BN eta LA-n (3b eta c irudiak), eta 6-20 mm-ko tartean nodulu gaiztoen eta onberen artean bereizketa bat ikusi zen (3d irudia). Kohorte honek 0,927ko AUC, 0,868ko espezifikotasuna eta 0,820ko sentikortasuna zituen 6 eta 20 mm-ko noduluen gaiztotasuna aurreikusteko (3e eta f irudiak). Gure emaitzek erakusten dute sailkatzaileak eraldaketa gaizto goiztiarrek eragindako aldaketa metabolikoak jaso ditzakeela, noduluaren tamaina edozein dela ere.
ad PCA profilen konparaketa talde zehatzen artean, 27 metabolitoren sailkatzaile metaboliko batean oinarrituta. CC eta BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. LA 6–20 mm-tan, LA 20–30 mm-ren aldean. g BN 6–20 mm eta LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Hartzailearen funtzionamendu-ezaugarriaren (ROC) kurba, 6–20 mm-ko noduluetarako bereizle-ereduaren errendimendua erakusten duena. f Probabilitate-balioak 6–20 mm-ko noduluetarako erregresio logistikoaren ereduan oinarrituta kalkulatu ziren. Lerro puntuatu grisak ebaki-balio optimoa adierazten du (0,455). Goiko zenbakiek Los Angeleserako proiektatutako kasuen ehunekoa adierazten dute. Erabili bi aldeetako Student-en t testa. PCA, osagai nagusien analisia. Kurbaren azpiko AUC azalera. Jatorrizko datuak iturburu-datuen fitxategien moduan ematen dira.
Lau lagin (44-61 urte bitartekoak), antzeko tamainako biriketako nodulu-tamainak (7-9 mm), hautatu ziren proposatutako gaiztakeria iragartzeko ereduaren errendimendua ilustratzeko (4a eta 4b irudiak). Hasierako baheketan, 1. kasua kaltzifikaziodun nodulu solido gisa aurkeztu zen, onberatasunarekin lotutako ezaugarria, eta 2. kasua, berriz, ezaugarri onbera nabarmenik gabeko nodulu indeterminatu partzialki solido gisa aurkeztu zen. Hiru TC eskaneo jarraipen-txandak erakutsi zuten kasu hauek 4 urteko epean egonkor mantendu zirela eta, beraz, nodulu onbertzat hartu zirela (4a irudia). TC eskaneo seriatuen ebaluazio klinikoarekin alderatuta, egungo sailkatzaile-ereduarekin egindako serumeko metabolitoen analisi bakarreko azterketak azkar eta zuzen identifikatu zituen nodulu onber hauek probabilitate-murrizketetan oinarrituta (1. taula). 3. kasuan, 4b irudiak pleura-erretrakzioaren zantzuak dituen nodulu bat erakusten du, eta hori gehienetan gaiztakeriarekin lotuta dago32. 4. kasua kausa onberaren zantzurik gabeko nodulu indeterminatu partzialki solido gisa aurkeztu zen. Kasu hauek guztiak gaiztotzat iragarri ziren sailkatzaile ereduaren arabera (1. taula). Biriketako adenokartzinomaren ebaluazioa azterketa histopatologikoaren bidez frogatu zen, biriketako erreskzio kirurgiaren ondoren (4b irudia). Kanpoko balidazio multzoarentzat, sailkatzaile metabolikoak zehaztasunez iragarri zituen 6 mm baino handiagoak ziren biriketako nodulu indeterminatuen bi kasu (10. irudi osagarria).
Bi nodulu onberen kasuen biriken leiho axialaren CT irudiak. 1. kasuan, 4 urteren buruan egindako CT eskaneatzeak 7 mm-ko nodulu solido egonkor bat erakutsi zuen beheko eskuineko lobuluan kaltzifikazioarekin. 2. kasuan, 5 urteren buruan egindako CT eskaneatzeak 7 mm-ko diametroa zuen nodulu egonkor eta partzialki solido bat erakutsi zuen goiko eskuineko lobuluan. b Biriken leiho axialeko CT irudiak eta I. estadioko adenokartzinomaren bi kasuen dagokien azterketa patologikoak, biriken ebakuntza egin aurretik. 3. kasuan, 8 mm-ko diametroa zuen nodulu bat erakutsi zuen goiko eskuineko lobuluan, pleura-erretraktuarekin. 4. kasuan, 9 mm-ko nodulu lurztatu partzialki solido bat erakutsi zuen goiko ezkerreko lobuluan. Erresekatutako biriketako ehunaren hematoxilina eta eosina (H&E) tindaketak (eskala-barra = 50 μm), biriketako adenokartzinomaren azinar hazkunde-eredua erakusten duena. Geziek CT irudietan detektatutako noduluak adierazten dituzte. H&E irudiak patologoak aztertutako (>3) eremu mikroskopiko anitzen irudi adierazgarriak dira.
Gure emaitzek, oro har, serumeko metabolitoen biomarkatzaileen balio potentziala erakusten dute biriketako noduluen diagnostiko diferentzialean, eta horrek erronkak sor ditzake TC baheketa ebaluatzerakoan.
Balioztatutako metabolito diferentzialen panel batean oinarrituta, aldaketa metaboliko nagusien korrelazio biologikoak identifikatzen saiatu ginen. MetaboAnalyst-ek egindako KEGG bideen aberaste-analisiak bi taldeen artean 6 bide komun nabarmen aldatu identifikatu zituen (LA vs. HC eta LA vs. BN, doitutako p ≤ 0,001, efektua > 0,01). Aldaketa hauek piruvatoaren metabolismoan, triptofanoaren metabolismoan, niazinaren eta nikotinamidaren metabolismoan, glukolisian, TCA zikloan eta purinaren metabolismoan izandako asaldurak izan ziren (5a irudia). Ondoren, metabolomika zuzendua egin genuen aldaketa nagusiak egiaztatzeko kuantifikazio absolutua erabiliz. Bide aldatu ohikoenetan metabolito ohikoenen zehaztapena hirukoitz kuadrupolo masa-espektrometria (QQQ) bidez, metabolito-estandar autentikoak erabiliz. Metabolomika-azterketaren helburu-laginaren ezaugarri demografikoak 4. taula osagarrian daude. Gure metabolomika-emaitza globalen antzera, analisi kuantitatiboak baieztatu zuen hipoxantina eta xantina, piruvatoa eta laktatoa handitu egin zirela LA-n BN eta HC-rekin alderatuta (5b irudia, c, p <0,05). Hala ere, ez zen metabolito hauetan desberdintasun esanguratsurik aurkitu BN eta HC artean.
LA taldeko metabolito nabarmen desberdinen KEGG bidearen aberaste-analisia, BN eta HC taldeekin alderatuta. Bi isatseko Globaltest bat erabili zen, eta p balioak Holm-Bonferroni metodoa erabiliz egokitu ziren (p ≤ 0,001 doitua eta efektuaren tamaina > 0,01). b–d Biolin grafikoak, hipoxantina, xantina, laktato, piruvato eta triptofano mailak erakusten dituztenak LC-MS/MS bidez zehaztutako HC, BN eta LA serumean (n = 70 talde bakoitzeko). Lerro puntu zuri eta beltzek mediana eta kuartila adierazten dituzte, hurrenez hurren. e Biolin grafikoak, SLC7A5 eta QPRT-ren Log2TPM (milioi bakoitzeko transkripzioak) mRNA adierazpen normalizatua erakusten duena biriketako adenokartzinomaren (n = 513), biriketako ehun normalarekin alderatuta (n = 59) LUAD-TCGA datu-multzoan. Kutxa zuriak kuartil arteko tartea adierazten du, erdiko lerro beltz horizontalak mediana, eta kutxatik hedatzen den lerro beltz bertikalak % 95eko konfiantza-tartea (CI). f SLC7A5 eta GAPDH espresioaren Pearson korrelazio-diagrama biriketako adenokartzinoman (n = 513) eta biriketako ehun normalean (n = 59) TCGA datu-multzoan. Eremu grisak % 95eko CI adierazten du. r, Pearson korrelazio-koefizientea. g LC-MS/MS bidez zehaztutako shRNA kontrol ez-espezifikoarekin (NC) eta shSLC7A5ekin (Sh1, Sh2) transfektatutako A549 zeluletan triptofano-maila normalizatuak. Talde bakoitzeko bost lagin biologikoki independenteen analisi estatistikoa aurkezten da. h NADt-ren (NAD osoa, NAD+ eta NADH barne) maila zelularrak A549 zeluletan (NC) eta SLC7A5 knockdown A549 zeluletan (Sh1, Sh2). Talde bakoitzeko hiru lagin biologikoki independenteen analisi estatistikoa aurkezten da. i A549 zelulen jarduera glikolitikoa SLC7A5 knockdown-a baino lehen eta ondoren azidotze estrazelularraren tasaren (ECAR) bidez neurtu zen (n = 4 lagin biologikoki independente talde bakoitzeko). 2-DG,2-desoxi-D-glukosa. Bi isatseko Student-en t testa erabili zen (b-h)n. (g-i)n, errore-barrek batez bestekoa ± SD adierazten dute, esperimentu bakoitza hiru aldiz egin zen modu independentean eta emaitzak antzekoak izan ziren. Jatorrizko datuak iturburu-datuen fitxategien moduan ematen dira.
LA taldean triptofanoaren metabolismoaren aldaketak izan duen eragin nabarmena kontuan hartuta, HC, BN eta LA taldeetan serumeko triptofano mailak ere ebaluatu genituen QQQ erabiliz. Ikusi genuen serumeko triptofanoa LA-n murriztu zela HC edo BN-rekin alderatuta (p < 0,001, 5d irudia), eta hori bat dator aurreko aurkikuntzekin, zeinak dioen zirkulazioan dauden triptofano mailak txikiagoak direla biriketako minbizia duten pazienteetan kontrol taldeko kontrol osasuntsuetan baino33,34,35. PET/CT trazadorea den 11C-metil-L-triptofanoa erabiliz egindako beste ikerketa batek aurkitu zuen biriketako minbizi ehunean triptofano seinalearen atxikipen denbora nabarmen handitu zela lesio onberekin edo ehun normalarekin alderatuta36. Hipotesi bat dugu: LA serumeko triptofanoaren jaitsierak biriketako minbizi zelulek triptofanoaren xurgapen aktiboa islatu dezakeela.
Jakina da, halaber, triptofano katabolismoaren kinurenina bidearen azken produktua NAD+ dela37,38, eta hau substratu garrantzitsua da glizeraldehido-3-fosfatoak 1,3-bisfosfoglizeratoarekin glukolisian duen erreakziorako39. Aurreko ikerketek triptofano katabolismoak immunitate-erregulazioan duen eginkizunean zentratu diren bitartean, guk egungo ikerketan triptofanoaren desregulazioaren eta bide glikolitikoen arteko elkarrekintza argitu nahi izan dugu. Solutoen garraiatzaileen 7. familiako 5. kidea (SLC7A5) triptofano garraiatzaile bat dela ezagutzen da43,44,45. Azido kinoliniko fosforibosiltransferasa (QPRT) kinurenina bidearen behealdean kokatutako entzima bat da, azido kinolinikoa NAMN46 bihurtzen duena. LUAD TCGA datu-multzoaren ikuskapenak agerian utzi zuen bai SLC7A5 bai QPRT nabarmen gorago erregulatuta zeudela tumore-ehunean ehun normalarekin alderatuta (5e irudia). Igoera hau biriketako adenokartzinomaren I. eta II. faseetan zein III. eta IV. faseetan ikusi zen (11. irudi osagarria), eta horrek triptofanoaren metabolismoan tumoregenesiarekin lotutako asaldura goiztiarrak adierazten ditu.
Gainera, LUAD-TCGA datu-multzoak korrelazio positiboa erakutsi zuen SLC7A5 eta GAPDH mRNAren adierazpenaren artean minbizia duten pazienteen laginetan (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5f irudia). Aitzitik, ez zen korrelazio esanguratsurik aurkitu gene-sinadura horien artean biriketako ehun normalean (r = 0,25, p = 0,06, 5f irudia). SLC7A5-en knockdown-ak (12. irudi osagarria) A549 zeluletan nabarmen murriztu zituen zelulen triptofano eta NAD(H) mailak (5g eta h irudiak), eta ondorioz, jarduera glukolitiko ahuldu egin zen zelulaz kanpoko azidotze-tasaren (ECAR) bidez neurtuta (1. irudia). 5i). Beraz, serumeko eta in vitro detekzioko aldaketa metabolikoetan oinarrituta, hipotesi bat dugu: triptofanoaren metabolismoak NAD+ sor dezake kinurenina bidearen bidez eta paper garrantzitsua jokatzen du glikolisia sustatzeko biriketako minbizian.
Ikerketek erakutsi dute LDCT bidez detektatutako biriketako nodulu zehaztugabe kopuru handi batek proba gehigarriak behar izatea ekar dezakeela, hala nola PET-CT, biriketako biopsia eta gehiegizko tratamendua, gaiztakeriaren diagnostiko faltsu positibo baten ondorioz.31 6. irudian erakusten den bezala, gure ikerketak balio diagnostiko potentziala duten serumeko metabolitoen panel bat identifikatu du, eta horrek CT bidez detektatutako biriketako noduluen arriskuen estratifikazioa eta ondorengo kudeaketa hobetu dezake.
Biriketako noduluak dosi baxuko tomografia konputatua (LDCT) erabiliz ebaluatzen dira, kausa onberak edo gaiztoak iradokitzen dituzten irudi-ezaugarriekin. Noduluen emaitza ziurgabeak jarraipen-bisita maizetara, esku-hartze beharrezkoak ez izatea eta gehiegizko tratamendua ekar ditzake. Balio diagnostikodun serumeko sailkatzaile metabolikoak sartzeak biriketako noduluen arriskuen ebaluazioa eta ondorengo kudeaketa hobetu dezake. PET positroi-igorpen tomografia.
AEBetako NLST ikerketaren eta Europako NELSON ikerketaren datuek iradokitzen dute arrisku handiko taldeak dosi baxuko tomografia konputatua (LDCT) erabiliz bahetzeak biriketako minbiziaren hilkortasuna murriztu dezakeela1,3. Hala ere, LDCT bidez detektatutako biriketako nodulu ustekabeko kopuru handien arriskuen ebaluazioa eta ondorengo kudeaketa klinikoa dira erronka handienak. Helburu nagusia LDCTn oinarritutako protokoloen sailkapen zuzena optimizatzea da, biomarkatzaile fidagarriak sartuz.
Biriketako minbizia kontrol osasuntsuekin alderatuz zenbait biomarkatzaile molekular identifikatu dira, hala nola odoleko metabolitoak15,17. Oraingo ikerketan, serumaren metabolomikaren analisia aplikatzean zentratu gara, LDCT bidez ustekabean detektatutako biriketako nodulu onberak eta gaiztoak bereizteko. Kontrol osasuntsuaren (HC), biriketako nodulu onberak (BN) eta I. estadioko biriketako adenokartzinomaren (LA) laginen serumaren metaboloma globala alderatu dugu UPLC-HRMS analisia erabiliz. Ikusi dugu HC eta BN-k antzeko profil metabolikoak zituztela, LA-k, berriz, aldaketa esanguratsuak erakutsi dituela HC eta BN-rekin alderatuta. Bi serum metabolito multzo identifikatu ditugu, LA HC eta BN-tik bereizten dutenak.
Gaur egungo LDCT bidezko nodulu onberak eta gaiztoak identifikatzeko eskema, batez ere noduluen tamainan, dentsitatean, morfologian eta denboran zeharreko hazkunde-tasan oinarritzen da30. Aurreko ikerketek erakutsi dute noduluen tamaina biriketako minbizia izateko probabilitatearekin estuki lotuta dagoela. Arrisku handiko pazienteetan ere, 6 mm-tik beherako noduluetan gaiztakeria izateko arriskua %1 baino txikiagoa da. 6 eta 20 mm bitarteko noduluen gaiztakeria izateko arriskua %8tik %64ra bitartekoa da30. Hori dela eta, Fleischner Elkarteak 6 mm-ko mozketa-diametroa gomendatzen du ohiko TC jarraipenerako.29 Hala ere, 6 mm baino handiagoak diren biriketako nodulu indeterminatuen (IPN) arriskuen ebaluazioa eta kudeaketa ez dira behar bezala egin31. Bihotzeko gaixotasun kongenitoen egungo kudeaketa normalean TC monitorizazio maizarekin itxaronaldi ernean oinarritzen da.
Metaboloma balioztatuan oinarrituta, lehen aldiz frogatu genuen metabolomika sinaduren gainjartzea pertsona osasuntsuen eta <6 mm-ko nodulu onberen artean. Antzekotasun biologikoa bat dator aurreko TC aurkikuntzekin, hau da, <6 mm-ko noduluetarako gaiztakeria arriskua nodulurik gabeko subjektuena bezain baxua dela.30 Kontuan izan behar da gure emaitzek ere erakusten dutela <6 mm-ko eta ≥6 mm-ko nodulu onberek antzekotasun handia dutela metabolomika profiletan, eta horrek iradokitzen du etiologia onberaren definizio funtzionala koherentea dela noduluaren tamaina edozein dela ere. Horrela, serumeko metabolito diagnostiko modernoen panelek analisi bakarra eman dezakete bazterketa-proba gisa noduluak hasieran TCan detektatzen direnean eta, agian, jarraipena murriztu. Aldi berean, biomarkatzaile metabolikoen panel berak ≥6 mm-ko tamainako nodulu gaiztoak nodulu onberetatik bereizten zituen eta tamaina bereko IPN eta ezaugarri morfologiko anbiguoetarako iragarpen zehatzak eman zituen TC irudietan. Serumeko metabolismo sailkatzaile honek ondo funtzionatu zuen ≥6 mm-ko noduluetan gaiztakeria aurreikusteko, 0,927ko AUC batekin. Gure emaitzek guztira hartuta, adierazten dute serumeko metabolomia-sinadura bereziek tumoreek eragindako aldaketa metaboliko goiztiarrak islatu ditzaketela eta arrisku-aurreikusle gisa balio potentziala izan dezaketela, noduluaren tamainatik independenteki.
Azpimarratzekoa da biriketako adenokartzinoma (LUAD) eta zelula ezkatatsuen kartzinoma (LUSC) direla biriketako minbizi ez-zelula txikien (NSCLC) mota nagusiak. LUSC tabakoaren kontsumoarekin oso lotuta dagoela kontuan hartuta47 eta LUAD CT baheketan detektatzen diren biriketako nodulu ustekabekoen histologia ohikoena dela kontuan hartuta48, gure sailkatzaile eredua I. estadioko adenokartzinoma laginetarako eraiki zen bereziki. Wangek eta lankideek LUADengan ere jarri zuten arreta eta bederatzi lipido-sinadura identifikatu zituzten lipidomika erabiliz, biriketako minbizi goiztiarra pertsona osasuntsuetatik bereizteko17. Gaur egungo sailkatzaile eredua I. estadioko 16 LUSC kasutan eta 74 nodulu onberetan probatu genuen eta LUSC iragarpenaren zehaztasun baxua ikusi genuen (AUC 0,776), eta horrek iradokitzen du LUADek eta LUSCek beren metabolomika-sinadurak izan ditzaketela. Izan ere, LUADek eta LUSCek etiologian, jatorri biologikoan eta aberrazio genetikoetan desberdinak direla frogatu da49. Beraz, beste histologia mota batzuk sartu beharko lirateke bahetze-programetan biriketako minbizia populazioan oinarritutako detektatzeko entrenamendu-ereduetan.
Hemen, biriketako adenokartzinoman gehien aldatzen diren sei bide identifikatu ditugu, kontrol osasuntsuekin eta nodulu onberekin alderatuta. Xantina eta hipoxantina purinen bide metabolito ohikoak dira. Gure emaitzekin bat etorriz, purinen metabolismoarekin lotutako bitartekariak nabarmen handitu ziren biriketako adenokartzinoma duten pazienteen serumean edo ehunetan, kontrol osasuntsuekin edo fase preinbaditzailean dauden pazienteekin alderatuta15,50. Xantina eta hipoxantina serumeko maila altuak minbizi-zelulen ugalketa azkarrak behar duen anabolismoa islatu dezake. Glukosaren metabolismoaren deserregulazioa minbiziaren metabolismoaren ezaugarri ezaguna da51. Hemen, piruvato eta laktatoaren igoera nabarmena ikusi dugu LA taldean HC eta BN taldearekin alderatuta, eta hori bat dator biriketako minbizi ez-zelula txikiko (NSCLC) pazienteen eta kontrol osasuntsuen serumeko metabolomaren profilean bide glukolitikoen anomaliei buruzko aurreko txostenekin. Emaitzak koherenteak dira52,53.
Garrantzitsua da, biriketako adenokartzinomen serumean piruvatoaren eta triptofanoaren metabolismoaren arteko alderantzizko korrelazioa ikusi dugula. Triptofano serumeko mailak murriztu egin ziren LA taldean HC edo BN taldearekin alderatuta. Interesgarria da, kohorte prospektibo bat erabiliz egindako aurreko ikerketa handi batek aurkitu zuen zirkulazioan dagoen triptofano maila baxuak biriketako minbizia izateko arrisku handiagoarekin lotuta zeudela 54. Triptofanoa elikagaietatik lortzen dugun aminoazido esentziala da. Ondorioztatzen dugu biriketako adenokartzinoman triptofano serumeko agortzeak metabolito honen agortze azkarra islatu dezakeela. Jakina da kinurenina bidearen bidezko triptofano katabolismoaren azken produktua dela de novo NAD+ sintesiaren iturria. NAD+ batez ere berreskuratze bidearen bidez sortzen denez, NAD+-k osasunean eta gaixotasunean triptofanoaren metabolismoan duen garrantzia zehaztu gabe dago oraindik46. TCGA datu-basearen gure analisiak erakutsi zuen triptofano garraiatzailearen solutu garraiatzailearen 7A5 (SLC7A5) adierazpena nabarmen handitu zela biriketako adenokartzinoman kontrol normalekin alderatuta, eta positiboki korrelazionatuta zegoela GAPDH entzima glukolitikoaren adierazpenarekin. Aurreko ikerketek batez ere triptofanoaren katabolismoak tumoreen aurkako erantzun immunologikoa zapaltzeko duen eginkizunean jarri dute arreta40,41,42. Hemen erakusten dugu SLC7A5-en knockdown bidez biriketako minbizi-zeluletan triptofanoaren xurgapena inhibitzeak zelulen NAD mailen jaitsiera eta aldi berean jarduera glukolitikoaren arintzea dakarrela. Laburbilduz, gure ikerketak oinarri biologiko bat eskaintzen du biriketako adenokartzinomaren eraldaketa gaiztoarekin lotutako serumeko metabolismoan izandako aldaketen inguruan.
EGFR mutazioak dira NSCLC duten pazienteengan eragile mutazio ohikoenak. Gure ikerketan, EGFR mutazioa duten pazienteen (n = 41) EGFR mota basatia duten pazienteen (n = 31) antzeko metaboloma-profil orokorrak zituztela ikusi genuen, nahiz eta azilkarnitina duten pazienteen EGFR mutante batzuen serum-mailak txikiagoak aurkitu genituen. Azilkarnitinen funtzio ezarria azil taldeak zitoplasmatik mitokondrio-matrizera garraiatzea da, eta horrek gantz-azidoen oxidazioa eragin zuen energia sortzeko 55. Gure aurkikuntzekin bat etorriz, azken ikerketa batek metaboloma-profil antzekoak identifikatu zituen EGFR mutantearen eta EGFR mota basatiko tumoreen artean, 102 biriketako adenokartzinomaren ehun-laginen metaboloma globala aztertuz50. Interesgarria da, azilkarnitina edukia ere aurkitu zela EGFR mutantearen taldean. Beraz, azilkarnitina-mailen aldaketek EGFR-k eragindako aldaketa metabolikoak eta azpiko bide molekularrak islatzen dituzten ala ez, azterketa gehiago merezi izan dezake.
Ondorioz, gure ikerketak biriketako noduluen diagnostiko diferentzialerako serumaren metaboliko sailkatzaile bat ezartzen du eta arriskuen ebaluazioa optimizatu eta TC eskanerraren bidezko kudeaketa klinikoa erraztu dezakeen lan-fluxu bat proposatzen du.
Ikerketa hau Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbizi Ospitaleko, Sun Yat-sen Unibertsitateko Lehenengo Ospitale Afiliatuaren eta Zhengzhou Unibertsitateko Minbizi Ospitaleko Etika Batzordeak onartu zuten. Aurkikuntza eta barne balidazio taldeetan, pertsona osasuntsuen 174 serum eta nodulu onberen 244 serum bildu ziren Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbiziaren Kontrolerako eta Prebentziorako Sailean urtero azterketa medikoak egiten zituzten pertsonengandik, eta 166 nodulu onber serum. I. estadioko biriketako adenokartzinomak Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbiziaren Zentrotik bildu ziren. Kanpo balidazio kohortean, 48 nodulu onber kasu, 39 I. estadioko biriketako adenokartzinoma kasu Sun Yat-sen Unibertsitateko Lehenengo Ospitale Afiliatuan eta 24 I. estadioko biriketako adenokartzinoma kasu Zhengzhou Minbiziaren Ospitaletik izan ziren. Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbizi Zentroak I. estadioko biriketako minbizi ezkatatsuaren 16 kasu ere bildu zituen, ezarritako sailkatzaile metabolikoaren gaitasun diagnostikoa probatzeko (pazienteen ezaugarriak 5. taula osagarrian ageri dira). Aurkikuntza-kohorteko eta barne-balidazioko kohorteko laginak 2018ko urtarrilaren eta 2020ko maiatzaren artean bildu ziren. Kanpo-balidazioko kohorteko laginak 2021eko abuztuaren eta 2022ko urriaren artean bildu ziren. Genero-alborapena minimizatzeko, gizonezko eta emakumezko kasu kopuru berdina esleitu zitzaion kohorte bakoitzari. Aurkikuntza Taldea eta Barne Berrikuspen Taldea. Parte-hartzaileen sexua autotxostenaren arabera zehaztu zen. Parte-hartzaile guztien baimen informatua lortu zen eta ez zen konpentsaziorik eman. Nodulu onberak zituzten subjektuak analisi unean 2 eta 5 urte bitartean CT eskaneatze puntuazio egonkorra zutenak ziren, kanpoko balioztatze lagineko kasu bat izan ezik, ebakuntza aurretik bildu eta histopatologia bidez diagnostikatu baitzen. Bronkitis kronikoaren salbuespenarekin. Biriketako adenokartzinoma kasuak biriketako erresekzioaren aurretik bildu eta diagnostiko patologiko bidez baieztatu ziren. Baraurik gabeko odol laginak serumaren bereizketa hodietan bildu ziren, antikoagulatzailerik gabe. Odol laginak ordubetez koagulatu ziren giro-tenperaturan eta ondoren 2851 × g-tan zentrifugatu ziren 10 minutuz 4 °C-tan serumaren gainnadantea biltzeko. Serumaren alikuotak -80 °C-tan izoztu ziren metabolitoa erauzi arte. Sun Yat-sen Unibertsitateko Minbiziaren Zentroko Minbiziaren Prebentzio eta Azterketa Medikoen Sailak 100 emaile osasuntsuren serum multzo bat bildu zuen, 40 eta 55 urte bitarteko gizon-emakume kopuru bera barne. Emaile bakoitzaren lagin bolumen berdinak nahastu ziren, lortutako multzoa alikuotatu eta -80 °C-tan gorde zen. Serumaren nahasketa erreferentziazko material gisa erabili zen kalitate-kontrolerako eta datuen estandarizaziorako.
Erreferentziazko seruma eta proba-laginak desizoztu eta metabolitoak erauzketa-metodo konbinatu bat erabiliz erauzi ziren (MTBE/metanola/ura) 56. Laburbilduz, 50 μl serum 225 μl izotzez hoztutako metanolarekin eta 750 μl izotzez hoztutako metil tert-butil eterrekin (MTBE) nahastu ziren. Nahastea irabiatu eta izotzean inkubatu ordubetez. Ondoren, laginak nahastu eta zurrunbiloan nahastu ziren 188 μl MS mailako urarekin, barne-estandarrekin (13C-laktatoa, 13C3-piruvatoa, 13C-metionina eta 13C6-isoleuzina, Cambridge Isotope Laboratories-etik erosiak). Ondoren, nahastea 15.000 × g-tan zentrifugatu zen 10 minutuz 4 °C-tan, eta beheko fasea bi hodietara transferitu zen (125 μL bakoitza) LC-MS analisietarako modu positiboan eta negatiboan. Azkenik, lagina lehortu zen abiadura handiko hutseko kontzentradore batean.
Metabolito lehorrak % 80ko azetonitrilo 120 μl-tan berreraiki ziren, 5 minutuz zurrunbiloan irabiatu ziren eta 15.000 × g-tan zentrifugatu ziren 10 minutuz 4 °C-tan. Gainnatanteak anbar koloreko beirazko flaskoetan sartu ziren mikrotxertoekin metabolomika azterketetarako. Metabolomikako analisi zuzendu gabea kromatografia likido ultra-errendimenduko-bereizmen handiko masa-espektrometria (UPLC-HRMS) plataforma batean egin zen. Metabolitoak Dionex Ultimate 3000 UPLC sistema bat eta ACQUITY BEH Amida zutabe bat (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) erabiliz bereizi ziren. Ioi positiboen moduan, fase mugikorrak % 95 (A) eta % 50 azetonitriloa (B) izan ziren, bakoitzak 10 mmol/L amonio azetato eta % 0,1 azido formiko zituela. Modu negatiboan, A eta B fase mugikorrek % 95 eta % 50 azetonitriloa zuten, hurrenez hurren, bi faseek 10 mmol/L amonio azetatoa zuten, pH = 9. Gradiente programa hau izan zen: 0–0,5 min, % 2 B; 0,5–12 min, % 2–50 B; 12–14 min, % 50–98 B; 14–16 min, % 98 B; 16–16,1 min, % 98–2 B; 16,1–20 min, % 2 B. Zutabea 40 °C-tan mantendu zen eta lagina 10 °C-tan laginketa automatikoan. Emari-abiadura 0,3 ml/min izan zen, injekzio-bolumena 3 μl. Elektroihinztadura ionizazio (ESI) iturri batekin egindako Q-Exactive Orbitrap masa espektrometro bat (Thermo Fisher Scientific) eskaneatze osoko moduan erabili zen eta ddMS2 monitorizazio moduarekin akoplatu zen datu bolumen handiak biltzeko. MS parametroak honela ezarri ziren: ihinztadura tentsioa +3.8 kV/- 3.2 kV, kapilarraren tenperatura 320 °C, babes-gasa 40 arb, gas laguntzailea 10 arb, zunda berogailuaren tenperatura 350 °C, eskaneatze-tartea 70–1050 m/h, bereizmena 70 000. Datuak Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) erabiliz eskuratu ziren.
Datuen kalitatea ebaluatzeko, kalitate-kontroleko (QC) lagin multzoak sortu ziren lagin bakoitzetik gainnadantearen 10 μL alikuota kenduz. Sei kalitate-kontroleko lagin injekzio aztertu ziren analisi-sekuentziaren hasieran UPLC-MS sistemaren egonkortasuna ebaluatzeko. Ondoren, kalitate-kontroleko laginak aldian-aldian sartzen dira multzoan. Ikerketa honetako serumeko laginen 11 multzo guztiak LC-MS bidez aztertu ziren. 100 emaile osasuntsuren serum-nahasketa multzo baten alikuotak erabili ziren erreferentzia-material gisa dagokien multzoetan, erauzketa-prozesua kontrolatzeko eta multzo arteko efektuak doitzeko. Aurkikuntza-kohortearen, barne-balidazio-kohortearen eta kanpoko balioztatze-kohortearen metabolomikako analisi zuzendu gabea egin zen Sun Yat-sen Unibertsitateko Metabolomika Zentroan. Guangdong Unibertsitateko Teknologia Analisi eta Proba Zentroko kanpoko laborategiak ere kanpoko kohorteko 40 lagin aztertu zituen sailkatzaile-ereduaren errendimendua probatzeko.
Erauzi eta berreraiki ondoren, serumeko metabolitoen kuantifikazio absolutua errendimendu ultra-handiko kromatografia likidoa-tandem masa-espektrometria erabiliz neurtu zen (Agilent 6495 hirukoitza kuadrupoloa), elektroihinztadura ionizazio (ESI) iturri batekin erreakzio anitzeko monitorizazio (MRM) moduan. ACQUITY BEH Amida zutabe bat (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) erabili zen metabolitoak bereizteko. Fase mugikorra % 90 (A) eta % 5 azetonitriloz (B) osatuta zegoen, 10 mmol/L amonio azetatoarekin eta % 0,1 amoniako disoluzioarekin. Gradiente programa hau izan zen: 0–1,5 min, % 0 B; 1,5–6,5 min, % 0–15 B; 6,5–8 min, % 15 B; 8–8,5 min, % 15–0 B; 8,5–11,5 min, % 0 B. Zutabea 40 °C-tan mantendu zen eta lagina 10 °C-tan laginketa automatikoan. Emari-tasa 0,3 mL/min izan zen eta injekzio-bolumena 1 μL. MS parametroak honela ezarri ziren: kapilar tentsioa ±3,5 kV, nebulizagailuaren presioa 35 psi, zorro-gasaren fluxua 12 L/min, zorro-gasaren tenperatura 350 °C, lehortzeko gasaren tenperatura 250 °C eta lehortzeko gasaren fluxua 14 l/min. Triptofano, piruvato, laktato, hipoxantina eta xantina-ren MRM bihurketak 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 eta 151,0–107,9 izan ziren, hurrenez hurren. Datuak Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) erabiliz bildu ziren. Serum laginetarako, triptofanoa, piruvatoa, laktatoa, hipoxantina eta xantina kuantifikatu ziren nahasketa estandarren soluzioen kalibrazio kurbak erabiliz. Zelula laginetarako, triptofano edukia barne estandarrarekin eta zelula proteina masarekin normalizatu zen.
Gailurren erauzketa (m/z eta atxikipen-denbora (RT)) Compound Discovery 3.1 eta TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) erabiliz egin zen. Multzoen arteko balizko desberdintasunak ezabatzeko, proba-laginaren gailur karakteristiko bakoitza multzo bereko erreferentzia-materialaren gailur karakteristikoarekin zatitu zen, ugaritasun erlatiboa lortzeko. Barne-estandarren desbideratze estandar erlatiboak, estandarizazioaren aurretik eta ondoren, 6. taula osagarrian ageri dira. Bi taldeen arteko desberdintasunak aurkikuntza faltsuaren tasaren (FDR<0,05, Wilcoxon zeinu-mailaren testa) eta tolestura-aldaketaren (>1,2 edo <0,83) arabera ezaugarritu ziren. Ateratako ezaugarrien MS datu gordinak eta erreferentziako serumak zuzendutako MS datuak 1. eta 2. datu osagarrietan ageri dira, hurrenez hurren. Gailurraren anotazioa lau identifikazio-maila definitutan oinarrituta egin zen, besteak beste, identifikatutako metabolitoak, ustez anotatutako konposatuak, ustez karakterizatutako konposatu-klaseak eta konposatu ezezagunak 22. Compound Discovery 3.1-en (mzCloud, HMDB, Chemspider) datu-baseen bilaketetan oinarrituta, MS/MSrekin bat datozen estandar balioztatuak edo mzCloud-en (puntuazioa > 85) edo Chemspider-en bat etortze zehatzeko anotazioak dituzten konposatu biologikoak hautatu ziren azkenean metaboloma diferentzialaren arteko tarteko gisa. Ezaugarri bakoitzerako gailurren anotazioak 3. Datu Osagarrietan sartzen dira. MetaboAnalyst 5.0 erabili zen metabolitoen ugaritasunaren batura-normalizatutako analisi unibertsalari dagokionez. MetaboAnalyst 5.0-k KEGG bidearen aberaste-analisia ere ebaluatu zuen metabolito esanguratsuki desberdinetan oinarrituta. Osagai nagusien analisia (PCA) eta karratu txikienen diskriminatzaile partzialen analisia (PLS-DA) ropls software paketea (1.26.4 bertsioa) erabiliz aztertu ziren, pilaketa normalizazioarekin eta eskalatze automatikoarekin. Noduluen gaiztakeria aurreikusteko metabolitoen biomarkatzaileen eredu optimoa erregresio logistiko bitarra erabiliz sortu zen, txikitze absolutu txikiena eta hautaketa operadorea erabiliz (LASSO, R paketea 4.1-3 bertsioa). Detekzio eta balidazio multzoetan bereizle ereduaren errendimendua AUC kalkulatuz karakterizatu zen, ROC analisian oinarrituta, pROC paketearen arabera (1.18.0 bertsioa). Probabilitate-muga optimoa ereduaren Youden indize maximoan oinarrituta lortu zen (sentsibilitatea + espezifikotasuna – 1). Atalasea baino txikiagoak edo handiagoak diren balioak dituzten laginak nodulu onberak eta biriketako adenokartzinoma gisa iragarriko dira, hurrenez hurren.
A549 zelulak (#CCL-185, American Type Culture Collection) % 10 FBS zuen F-12K ingurunean hazi ziren. SLC7A5 helburu duten ile-punta laburreko RNA (shRNA) sekuentziak eta helbururik gabeko kontrol bat (NC) pLKO.1-puro bektore lentibiralean sartu ziren. shSLC7A5-en antisentido sekuentziak hauek dira: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5 (#5347) eta tubulinaren (#2148) aurkako antigorputzak Cell Signaling Technology-tik erosi ziren. SLC7A5 eta tubulinaren aurkako antigorputzak 1:1000 diluzioan erabili ziren Western blot analisietarako.
Seahorse XF estres glukolitiko probak azidotze estrazelularra (ECAR) neurtzen du. Saiakuntzan, glukosa, oligomizina A eta 2-DG sekuentzialki eman ziren ECAR bidez neurtutako zelulen gaitasun glukolitikoa probatzeko.
Kontrol ez-zuzenarekin (NC) eta shSLC7A5 (Sh1, Sh2) transfektatutako A549 zelulak gau osoan zehar 10 cm-ko diametroko plateretan landatu ziren. Zelulen metabolitoak 1 ml izotzez hoztutako % 80ko metanol urtsuarekin erauzi ziren. Metanol-disoluzioan zeuden zelulak arraskatu, hodi berri batean bildu eta 15.000 × g-tan zentrifugatu ziren 15 minutuz 4 °C-tan. Bildu 800 µl gainnadante eta lehortu abiadura handiko hutseko kontzentradore bat erabiliz. Ondoren, metabolito lehorren pellet-ak triptofano mailak aztertu ziren LC-MS/MS erabiliz, goian deskribatutako moduan. A549 zeluletan (NC eta shSLC7A5) zelulen NAD(H) mailak NAD+/NADH kolorimetria kit kuantitatibo bat erabiliz neurtu ziren (#K337, BioVision) fabrikatzailearen argibideen arabera. Proteina mailak lagin bakoitzerako neurtu ziren metabolitoen kopurua normalizatzeko.
Ez zen metodo estatistikorik erabili laginaren tamaina aldez aurretik zehazteko. Biomarkatzaileak aurkitzera bideratutako aurreko metabolomika-ikerketak15,18 erreferentzia gisa hartu dira tamaina zehazteko, eta txosten hauekin alderatuta, gure lagina egokia zen. Ez zen lagin bat ere baztertu ikerketa-kohortetik. Serumeko laginak ausaz esleitu ziren aurkikuntza-talde bati (306 kasu, % 74,6) eta barne-balidazio-talde bati (104 kasu, % 25,4) zuzendu gabeko metabolomika-ikerketetarako. Era berean, ausaz hautatu genituen talde bakoitzetik 70 kasu metabolomika-ikerketa zuzenduetarako aurkikuntza-multzotik. Ikertzaileak itsututa zeuden talde-esleipenarekin LC-MS datuak biltzeko eta aztertzeko prozesuan. Metabolomika-datuen eta zelula-esperimentuen analisi estatistikoak Emaitzak, Irudien Legendak eta Metodoak ataletan deskribatzen dira. Zelulen triptofanoaren, NADTaren eta jarduera glukolitikoaren kuantifikazioa hiru aldiz egin zen modu independentean, emaitza berdinekin.
Ikerketaren diseinuari buruzko informazio gehiago lortzeko, ikus artikulu honekin lotutako Natural Portfolio Txostenaren Laburpena.
Ateratako ezaugarrien MS datu gordinak eta erreferentziako serumaren MS datu normalizatuak 1. eta 2. Datu Osagarrietan ageri dira, hurrenez hurren. Ezaugarri bereizgarrien gailurren anotazioak 3. Datu Osagarrietan aurkezten dira. LUAD TCGA datu-multzoa https://portal.gdc.cancer.gov/ helbidetik deskargatu daiteke. Grafikoa marrazteko sarrera-datuak iturburu-datuetan ematen dira. Artikulu honetarako iturburu-datuak ematen dira.
Biriketako Baheketa Ikerketa Talde Nazionala, etab. Biriketako minbiziaren hilkortasuna murriztea dosi baxuko tomografia konputatuarekin. Ingalaterra iparraldea. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR eta Prophet, PC Biriketako minbiziaren baheketa dosi baxuko CT helikoidal erabiliz: National Lung Screening Study (NLST) ikerketaren emaitzak. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Biriketako minbiziaren hilkortasuna murriztea CT bolumiko bidezko baheketa erabiliz ausazko entsegu batean. Ingalaterra iparraldea. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Argitaratze data: 2023ko irailaren 18a